| License: Publishing license for publications excluding print on demand (24MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-327133
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.32713
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Number of Pages: | 262 |
| Date: | September 2016 |
| Referee: | Prof. Dr. Gunter Meister |
| Date of exam: | 13 October 2015 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Lehrstuhl für Biochemie I |
| Keywords: | Argonaute, Ago, chromatin, DAM-ID, DAMID, nucleus |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 32713 |
Abstract (English)
A main regulator of mRNA abunance in the cell are Argonaute (Ago) proteins. Agos are guided by an associating small RNA molecule to complementary mRNAs in the cytoplasm resulting in their translational repression and degradation. Apart from their cytoplasmic function which is conserved across many species, some Ago proteins were also found to influence mRNA abundance at the step of transcription ...
Abstract (English)
A main regulator of mRNA abunance in the cell are Argonaute (Ago) proteins. Agos are
guided by an associating small RNA molecule to complementary mRNAs in the cytoplasm resulting in their translational repression and degradation. Apart from their cytoplasmic function which is conserved across many species, some Ago proteins were also found to influence mRNA abundance at the step of transcription in the nucleus of cells. There, Ago proteins bound to a small RNA recognize nascent transcripts of mRNAs and transposable elements by complementary base pairing leading to their transcriptional silencing. This is often linked to the recruitment of chromatin modifying factors. The nuclear function of Ago proteins, which was studied especially in yeast, plants and worms, was found to be inducible also in human cells by targeting Ago to chromatin by promoter complementary small RNA species [Meister, 2013]. Therefore, the question after endogenous triggers and the genomic target sites of this potential function emerged.
In order to identify potential target gene loci in human somatic cells and mouse embryonic stem cells, we examined Ago chromatin interaction sites by applying two complementary techniques, Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) and DNA Adenine Methyltransferase Identification (DAMID) combined with Next-Generation Sequencing analysis.
The ChiP experiments using three different antibodies for Ago1 and Ago2, yielded only low numbers of overlapping peaks and bad signal-to-noise levels. This suggested either lack of strong chromatin interaction sites of Ago proteins or experimental failure.
Next, we applied the antibody-independent DAMID approach. This method deduces chromatin association sites from DNA-methylation events caused by a recombinant fusion protein consisting of a DNA methyltransferase from E. coli and the target protein [Vogel et al., 2006]. Despite successful establishment of the method, which was shown by the results for a positive control, the validation of the predicted nuclear Ago-binding sites by ChIP experiments failed for the human cell line. For mESC only few significant peaks were detected which are currently validated by our collaboration partner. Excitingly, both DAMID experiments showed high enrichment of mitochondrial DNA sequences in Ago samples compared to controls. Therefore, we tested a potential mitochondrial localisation of Ago proteins, which was also suggested by hints in the current literature but was not thoroughly assessed [Bian et al., 2010; Bandiera et al., 2011; Sripada et al., 2012; Zhang et al., 2014]. Assisted by the expertise of the lab of Prof. Dr. P. Rehling in mitochondrial biology, we analysed import and localisation of Ago in mitochondria. While some of the experiments supported a potential inter membrane space localisation, no evidence for matrix-import required for specific interaction of Ago proteins with mitochondrial DNA could be found.
When the results from mitochondrial localisation were combined with in depth analysis of the sequencing reads form the DAMID experiments, it appeared that a high fraction of the reads were highly amplified non-specific mitochondrial fragments reducing the complexity of DNA library. As implied in the literature [Casbon et al., 2011], this low complexity has a negative influence on quantification of the lower abundant DNA fragments in the library.
In conclusion, we can assume that the DAMID approach is also feasible for Ago proteins but needs further improvements like nuclear targeting and depletion of mitochondrial sequences.
Translation of the abstract (German)
Argonatue Proteine (Agos) sind wichtige Regulatoren der mRNA Konzentration im Cytoplasma. Um eine mRNA zu erkennen assoziieren Agos mit kurzen RNA Molekülen (small RNAs ~21 nt), die komplementär zur Ziel-mRNA sind und mit dieser Basenpaare bilden können. Nachdem Ago an eine mRNA gebunden hat, rekrutiert es weitere Faktoren die zur translationellen Repression und mRNA Degradation ...
Translation of the abstract (German)
Argonatue Proteine (Agos) sind wichtige Regulatoren der mRNA Konzentration im Cytoplasma. Um eine mRNA zu erkennen assoziieren Agos mit kurzen RNA Molekülen (small RNAs ~21 nt), die komplementär zur Ziel-mRNA sind und mit dieser Basenpaare bilden können. Nachdem Ago an eine mRNA gebunden hat, rekrutiert es weitere Faktoren die zur translationellen Repression und mRNA Degradation führen.
Zusätzlich zur seiner cytoplasmatischen Funktion, die in vielen Organismen konserviert ist, wurde ein Einfluss von Ago auf die mRNA Transkription im Zellkern gefunden. Hier bindet Ago mit Hilfe eines kurzen RNA Moleküls an ein komplementäres mRNA Transkript oder Transkript eines repetitiven Elements, während dieses gerade von der RNA Polymerase synthetisiert wird. Ago rekrutiert meist Chromatin modifizierende Enzyme und führt so zu transkriptionellen Inhibition und Stilllegung des genomischen Lokus. Dieser vor allem in Spalthefe, Pflanzen und Fadenwürmern im Detail untersuchte Prozess konnte jüngst auch in menschlichen Zellen mit Hilfe von Promotor-komplementären siRNAs (small interfering RNAs) induziert werden [Meister, 2013]. Deshalb interessierte mich, ob man auch endogene Ago-Chromatin Bindungsstellen gefunden werden können bei denen diese Assoziation durch einen zellulären Faktor gesteuert wird.
Zur Identifikation von Ago-Chromatin Bindungsstellen benutzte ich zwei komplementäre Techniken, Chromatin Immunpräzipitation (ChIP) und DNA-Adenin-Methyltransferase Identifikation (DAMID), die ich mit Hoch-Durchsatz-Sequenzierung (NGS) koppelte. Das ChIP-Experiment, durchgeführt mit je drei Ago1- und Ago2-spezifischen Antikörpern, resultierte jedoch in wenigen konservierten Bindungsstellen und zeigte starke unspezifische Signale. Dies könnte einerseits durch fehlende Ago-Chromatin Bindungstellen oder andererseits durch einen experimentellen Fehler erklärt werden. Anschließend führte ich das Antikörper-unabhängige DAMID Experiment in menschlichen somatischen Zellen und embryonalen Stammzellen aus Mäusen (mESC) durch. Bei dieser Technik wird ein Fusionsprotein von DNA-Adenin-Methyltransferase (DAM aus E.coli) und Ago in den Zellen exprimiert. Wird das Fusionsprotein zum Chromatin rekrutiert, führt es zu DNA-Methylierungen in der Umgebung der Bindestelle [Vogel et al., 2006]. Obwohl die Technik erfolgreich etabliert werden konnte, was ich mit einer bereits publizierten positive Kontrolle zeigte, war es unmöglich die aus dem DAMID Experiment abgeleiteten Ago-Chromatin Bindungsstellen mittels ChIP zu validieren. Für mESC konnte ich ein paar signifikante Bindungsstellen für Ago im DAMID Experiment bestimmen. Diese werden derzeit von unserem Kooperationspartner genauer untersucht.
Interessanterweise zeigten beide DAMID Experimente eine starke Anreicherung mitochondrialer Sequenzen in den Ago-spezifischen Proben im Vergleich zu Kontrollproteinen. Deshalb untersuchte ich auch die potentielle Lokalisation von Ago in Mitochondrien die bereits in mehreren Publikation angedeutet aber nicht im Detail untersucht worden war [Bian et al., 2010; Bandiera et al., 2011; Sripada et al., 2012; Zhang et al., 2014]. Dazu kollaborierte ich mit der Gruppe von Prof. Dr. P. Rehling einem Spezialist für die Biologie der Mitochondrien. Die durchgeführten Assoziations- und Lokalisationsexperimente unterstützen jedoch nur zum Teil eine Intermembranraum Lokalisation von Ago. Kein Hinweis wurde für einen Import von Ago in die mitochondrielle Matrix gefunden die für eine spezifische DNA-Methelierung in den DAMID Experimenten zwingend gewesen wäre.
Verbindet man abschließend die Ergebnisse beider Teile, stellen sich die Sequenzen mitochondriellen Ursprungs als Kontamination des DAMID Experiments dar, welche die Komplexität der „DNA-library“ stark reduzierten und die korrekte Quantifizierung potentieller Ago Bindungsstellen erschwerten oder unmöglich machten [Casbon et al., 2011].
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Ago-Chromatin Bindungsstellen mit Hilfe des DAMID Experiment identifiziert werden könnten. Jedoch muss dazu mitochondirelle DNA entfernt werden. Weiterhin könnte man die Detektion verbessern indem man das DAM-Ago Fusionsprotein mittels Kernsignal im Zellkern leicht anreichert.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 23:26
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