Zusammenfassung

Im Rahmen dieser Arbeit sollte die Funktion der cGKI in der Niere untersucht werden. Es ist bereits bekannt, dass cGKs an der renalen Hämodynamik und der Fibrose beteiligt sind. Wir analysierten insbesondere die Rolle der cGKI bei der Elektrolytausscheidung, Diurese sowie der Dehydratation. cGKI wird vor allem im renalen Interstitium, in Mesangialzellen des Glomerulus und im juxtaglomerulären Apparat exprimiert. Für die Durchführung der Versuche wurden cGKI-KO- und cGKIα-rescue-Mäuse verwendet. In cGKIα-rescue-Mäusen wird nach Total-knockout der cGKI die α-Isoform der cGKI unter Kontrolle eines Glattmuskel-Promotors exprimiert. Bei der cGKIα-rescue-Linie findet man keine Expression der cGKIα in renalen Strukturen, sondern lediglich in Arteriolen.
Vorhergehende Studien postulierten eine Beteiligung von NO/cGMP an der sog. Dehydration Natriurese. Es sollte daher abgeklärt werden, ob cGKI dabei eine Rolle spielt. Die Versuche, bei denen den Mäusen Wasser entzogen wurde, ergaben weder bei der Analyse des Urins noch des Blutes Unterschiede zwischen den beiden Genotypen. Daraus lässt sich schließen, dass der NO/cGMP/cGKI-Signalweg bei der Regulation des Elektrolythaushalts während Wasserentzug vermutlich keine Rolle spielt.
Frühere Arbeiten wiesen auf einen Einfluss von NO/cGMP auf die Regulation der Aktivität des NKCC2 hin. In der vorliegenden Arbeit konnte eine Beteiligung des cGMP/cGKI-Signalwegs an der Regulation des Na+/K+/2Cl--Cotransporters gezeigt werden. Dabei war der Nachweis der mRNA Expression von cGKI im corticalen und medullären TAL ein entscheidender Aspekt. Die Verabreichung von Furosemid führte bei Wildtyp- jedoch nicht bei cGKIα-rescue-Mäusen zur Zunahme der Phosphorylierung und Membrantranslokation von NKCC2. cGKIα-rescue-Mäuse schieden zudem nach Injektion des Diuretikums signifikant erhöhtes Urinvolumen, Natrium- und Chloridionen aus. Unter basalen Bedingungen unterschieden sich die Urinparameter der beiden Genotypen nicht voneinander. Die Verabreichung von Furosemid erhöhte die Vasopressinkonzentration in Wildtyp- und cGKIα-rescue-Mäusen auf gleiche Weise. Da sich aber die Phosphorylierung von NKCC2 zwischen den Genotypen unterschied, wird die unterschiedliche Diurese nicht durch unterschiedliche Sekretion von Vasopressin verursacht. Auch Renin konnte als Grund für die beobachteten Unterschiede zwischen den beiden Genotypen ausgeschlossen werden. Vermutlich vermittelt cGKI einen kompensatorischen Effekt als Antwort auf die Furosemid-Gabe.
In weiterführenden Studien könnte nun untersucht werden, über welchen Mechanismus cGKI die Aktivität von NKCC2 beeinflusst. Ein möglicher Anhaltspunkt wäre die Regulation der Phosphatase Calcineurin, die NKCC2 dephosphoryliert. Des Weiteren würde eine Beteiligung von RhoA bei der Endozytose in Frage kommen. Auch die Bedeutung von SNARE Proteinen bei der Exozytose von NKCC2 stellt einen Angriffspunkt der cGKI dar. Es wäre zudem interessant, auf welche Weise Furosemid zu einer Aktivierung von cGKI führt.

Conclusion
Sodium chloride reabsorption in the thick ascending limb of the loop of Henle is mediated by the Na+-K+-2Cl- cotransporter (NKCC2). The loop diuretic furosemide is a potent inhibitor of NKCC2. However, less is known about the mechanism regulating the electrolyte transporter. Considering the well-established effects of nitric oxide on NKCC2 activity, cGMP is likely involved in this regulation. cGKI (PKG, cGMP dependent protein kinase I) is a cGMP target protein that phosphorylates different substrates after activation through cGMP. We investigated the potential correlation between the cGMP / cGKI pathway and NKCC2 regulation. We treated wild type (wt) and cGKIα-rescue mice with furosemide. cGKIα-rescue mice expressed cGKIα only under the control of the smooth muscle specific transgelin (SM22) promoter in a cGKI deficient background. Furosemide treatment increased the urine excretion of sodium and chloride in cGKIα-rescue mice compared to that in wt mice. We analysed the phosphorylation of NKCC2 by Western blotting and immunostaining using the phosphospecific antibody R5. The administration of furosemide significantly increased the phosphorylated NKCC2 signal in wt but not in cGKIα-rescue mice. NKCC2 activation led to its phosphorylation and membrane translocation. To examine whether cGKI was involved in this process, we analysed VASP (vasodilator-stimulated phosphoprotein), which is phosphorylated by cGKI. Furosemide injection resulted in increased VASP phosphorylation in wt mice. We hypothesize that furosemide administration activated cGKI, leading to NKCC2 phosphorylation and membrane translocation. This cGKI-mediated pathway could be a mechanism to compensate for the inhibitory effect of furosemide on NKCC2.