| License: Publishing license for publications including print on demand (197MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-335509
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.33550
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 7 April 2016 |
| Referee: | PD Dr. Attila Németh |
| Date of exam: | 10 March 2016 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Lehrstuhl für Biochemie III > House of the Ribosome |
| Keywords: | Aging, Nucleolus, Nuclear Architecutre |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 33550 |
Abstract (English)
The nucleus of mammalian cells consists of several structural and functional domains, of which the nucleolus is the largest one. Although its primary function in the synthesis of ribosomal RNA and early steps of ribosome assembly is well characterized and its role in stress sensing, cell cycle regulation and RNA modification has been revealed, the involve- ment of the nucleolus in genome ...
Abstract (English)
The nucleus of mammalian cells consists of several structural and functional domains, of which the nucleolus is the largest one. Although its primary function in the synthesis of ribosomal RNA and early steps of ribosome assembly is well characterized and its role in stress sensing, cell cycle regulation and RNA modification has been revealed, the involve- ment of the nucleolus in genome organization is less well understood. Nucleolus-associated chromosomal domains (NADs) were initially described independently by two different lab- oratories, providing a snapshot of the nucleolus-associated genome in HeLa and HT1080 human cancer cells (N ́emeth et al., 2010; van Koningsbruggen et al., 2010). These inves- tigations showed that NADs represent mainly a specific heterochromatin compartment. However, NADs have not been mapped in normal diploid cells and other species than human. Moreover, the dynamics of the nucleolus-associated chromatin during diverse cel- lular processes such as cellular aging, or after inhibition of nucleolar transcription remained largely unknown.
Here, the effect of different nucleolus isolation protocols on the mapping of NADs and on the identification of histone post-translational modifications (PTMs) by masss spectrom- etry were monitored first. The results revealed robust, comparable mappability of NADs under various conditions, but differences in the maintaining of PTMs depending on the nucleolus isolation procedure. Next, the dynamics of nucleolus-associated chromatin was investigated during replicative senescence in IMR90 human embryonic fibroblasts. In vitro human diploid fibroblasts stop dividing after a certain number of cell divisions (Hayflick, 1965), a process called replicative senescence. During this process the nuclear architecture and nucleolar morphology get largely rearranged (Bridger et al., 2000; Mehta et al., 2007; Hein et al., 2011). The nucleolar hallmarks of senescent cells include increased size and fu- sion of nucleoli, furthermore chromatin and DNA methylation changes of ribosomal DNA (rDNA) (Hein et al., 2011). In the course of this study the nucleolus association of chromo- somal domains was mapped using comparative genomic hybridization on high-resolution microarrays. The initial analyses suggest that NADs are stable units and their genomic maps show only minor differences between the population of proliferating and senescent IMR90 cells. Three-dimensional analysis of nucleolar morphology provided quantitative data about the increase of nucleolar volume in senescent IMR90 cells and the accompa- nying decrease of their number per cell. Immunostaining of histone PTMs in proliferating and senescent IMR90 cells revealed that the distribution of a marker for constitutive het- erochromatin, trimethylation of the lysine 9 of histone H3 (H3K9me3), exhibits the most remarkable changes at the nucleoli during cellular aging. In senescent cells this histone-modification was depleted in the perinucleolar space, whereas a notable alteration in its distribution, but only a minor change in its relative amount was visible at the nuclear periphery, another characteristic site of heterochromatin accumulation. Immuno-FISH ex- periments revealed firstly that the localization of rDNA arrays with respect to nucleoli does not change remarkably during cellular senescence, secondly that senescence-associated dis- tension of satellites goes together with their disassociation from nucleoli, moreover that the localization of selected genomic regions frequently, but not completely corresponds to the nucleolus association states, which were observed in high-throughput genomic analyses.
Finally, nucleolus-associated DNA was isolated from mouse embryonic fibroblast cells, in which inhibition of ribosomal RNA transcription was achieved by induced depletion of the Upstream Binding Factor (UBF) protein, an essential factor of nucleolar RNA polymerase I transcription in vivo (Hamdane et al., 2014). Here again data were collected in high-resolution comparative genomic hybridization experiments for future bioinformatic analyses. In addition, 3D immuno-FISH experiments were performed to monitor large-scale alterations of nuclear and nucleolar architecture. The results illustrated, that the rDNA tends to form discrete foci, which get condensed and co-localized with major satellite repeat clusters at the centromeres.
In summary, in this study nucleoli were isolated from different human and mouse cells and their DNA and protein content was subjected to high-throughput genomic and mass spectrometry analyses, respectively. In addition, the dynamics of the nucleolus-associated chromatin was investigated in replicative senescence in human embryonic fibroblasts. The results shed new light on the role of the nucleolus in genome organization during these processes and provide a basis for further investigations.
Translation of the abstract (German)
Der Nukleolus ist die Gr ̈oßte von verschiedenen strukturellen und funktionellen Dom ̈anen im Kern von S ̈augetierzellen. Obwohl seine prim ̈are Funktion, die Synthese ribosomaler RNA und fru ̈he Schritte der Ribosomenassemblierung gut beschrieben sind und seine Rolle in der Stresswahrnehmung, Zellzyklusregulierung und RNA Modifikation beschrieben wu- rde, ist wenig u ̈ber seine Rolle im Bezug ...
Translation of the abstract (German)
Der Nukleolus ist die Gr ̈oßte von verschiedenen strukturellen und funktionellen Dom ̈anen im Kern von S ̈augetierzellen. Obwohl seine prim ̈are Funktion, die Synthese ribosomaler RNA und fru ̈he Schritte der Ribosomenassemblierung gut beschrieben sind und seine Rolle in der Stresswahrnehmung, Zellzyklusregulierung und RNA Modifikation beschrieben wu- rde, ist wenig u ̈ber seine Rolle im Bezug auf die Genomorganisierung bekannt. Nukleolus- assoziierte Chromosomendom ̈anen (NADs) wurden erstmals unabh ̈angig in zwei unter- schiedlichen Laboren indentifiziert und lieferten einen U ̈berblick u ̈ber das nukleolus-as- soziierte Genom in HeLa und HT1080 Zellen (N ́emeth et al., 2010; van Koningsbruggen et al., 2010). Diese Experimente zeigten, dass NADs haupts ̈achlich heterochromatische Re- gionen beinhalten. Jedoch wurden NADs bisher nicht in normalen diploiden Zellen sowie anderen Spezies ausser dem Menschen identifiziert. Außerdem blieb die Dynamik von nuk- leolusassoziertem Chromatin w ̈ahrend zellul ̈arer Prozesse wie der zellul ̈aren Alterung oder nach der Inhibierung nukleol ̈arer Transkripition weitgehend unbekannt.
Hier wurden zuerst Effekte von verschiedenen Protokollen zur Nukleolusisolierung auf die Identifizierung von NADs und der Identifizierung von post-translationalen Histonmodifika- tionen (PTMs) mit Massenspektrometrie untersucht. Ergebnisse zeigten eine vergleichbare Identifizierung von NADs unter verschiedenen Bedingungen, aber auch Unterschiede in der Erhaltung von PTMs abh ̈angig von der Art der Nukleolusisolierung. Als n ̈achstes wurde die Dynamik von nukleolus-assoziiertem Chromatin w ̈ahrend replikativer Seneszenz in IMR90 humanen embryonischen Fibroblasten untersucht. In vitro h ̈oren humane diploide Fibroblasten nach einer bestimmten Anzahl an Zellteilungen auf sich zu teilen (Hayflick, 1965), dieser Prozess ist bekannt als replikative Seneszenz w ̈ahrend dessen die nukle ̈are Architektur und nukleol ̈are Morphologie einer umfangreichen Umorganisierung unterliegen (Bridger et al., 2000; Mehta et al., 2007; Hein et al., 2011). Nukleoli in seneszenten Zellen zeichnen sich durch ihre erh ̈ohte Gr ̈oße und ihr Verschmelzen aus, außerdem ver ̈andert sich der Status der Methylierung von Chromatin und ribosomaler DNA (rDNA) (Hein et al., 2011). Im Verlauf dieser Arbeit wurden NADs mittels vergleichender genomischer Hybridisierung auf hochaufl ̈osenden Microarrays identifiziert. Vorl ̈aufige Analysen zeigten NADs als stabile Dom ̈anen und ihre genomische Kartierung ergab nur kleine Unterschiede zwischen proliferierenden und seneszenten Zellpopulationen. Dreidimensionale Analysen der nukleol ̈aren Morphologie lieferten quantitative Daten u ̈ber die Zunahme des Volumens von Nukleoli in seneszenten IMR90 Zellen und die parallele Reduzierung ihrer Anzahl pro Zelle. Immunof ̈arbungen von Histon PTMs in proliferierenden und seneszenten IMR90 Zellen zeigten, dass sich die Verteilung eines Markers fu ̈r konstitutives Heterochromatin, trimethylierung von Histon H3 an Lysin 9 (H3K9me3), w ̈ahrend der zellul ̈aren Alterung am meisten am Nukleolus ver ̈andert. In seneszenten Zellen war diese Histonmodifika- tion abgereichert an Nukleoli, wohingegen eine ver ̈anderte Verteilung aber nur ein kleiner Unterschied in der relativen H ̈aufigkeit an der Kernperipherie, einem weiteren typischen Bereich fu ̈r die Akkumulierung von Heterochromatin, erkennbar war. Immuno-FISH Ex- perimente zeigten einserseits, dass sich die Lokalisation von rDNA Arrays w ̈ahren der zellul ̈aren Seneszenz im Bezug auf Nukleoli nicht entscheidend ̈andert, andererseits, dass die seneszenz-assoziierte Distension von Satelliten DNA mit ihrer Dissoziation von Nukleoli einhergeht. Außerdem, wurde gezeigt, dass die Lokalisierung ausgew ̈ahlter genomischer Re- gionen h ̈aufig, aber nicht immer mit dem Status der Nukleolusassoziation u ̈bereinstimmt, welche in genomischen Hochdurchsatzanalysen ermittelt wurden.
Zuletzt wurde nukleolus-assoziierte DNA aus embryonischen Mausfibroblasten isoliert, in welchen eine Inhibierung von ribosomaler RNA Transkription durch die Depletion des Up- stream Binding Factor (UBF) Proteins erreicht wurde, welches ein essentieller Bestandteil der nukleol ̈aren RNA Polymerase I Transkription in vivo ist (Hamdane et al., 2014). Auch hier wurden Daten von hochaufl ̈osender vergleichender genomischer Hybridisierung fu ̈r ku ̈nftige bioinformatische Analysen gesammelt. Zus ̈atzlich wurden 3D immuno-FISH Ex- perimente durchgefu ̈hrt, um großr ̈aumige Ver ̈anderungen in der Kernarchitektur und der Morphologie von Nukeoli zu unterzuschen. Ergebnisse zeigten, dass die rDNA dazu tendiert diskrete Bereiche zu formen, welche dann kondensieren um dann mit Major Satelliten DNA Klustern an den Zentromeren zu kolokalisieren.
Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit Nukleoli aus verschiedenen humanen und muri- nen Fibroblasten Zelllinien isoliert und ihre Protein- und DNA-Bestandteile wurden jeweils mittels Hochdurchsatzgenmomik und -spektrometrischen Methoden analysiert. Zus ̈atzlich wurde die Dynamik von nukleolus-assoziiertem Chromatin in replikativer Seneszenz in hu- manen embryonischen Fibroblasten untersucht. Die Ergebnisse werfen neues Licht auf die Rolle des Nukleolus in der Genomorganisierung w ̈ahrend dieser Prozesse and bieten eine Basis fu ̈r zuku ̈nftige Analysen.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 22:52
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