| License: Publishing license for publications including print on demand (37MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-336309
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.33630
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Date: | 19 February 2017 |
| Referee: | Prof. Dr. Joachim Wegener |
| Date of exam: | 19 February 2016 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik > Bioanalytik und Biosensorik (Prof. Joachim Wegener) |
| Keywords: | Impedanzanalyse, adhärente Zellen, Mikropartikel/ impedance analysis, adherent cells, microparticles |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 33630 |
Abstract (English)
This thesis provides a model study on the information content of multimodal impedance-based assays to assess the impact of microscale particles on cell physiology of mammalian cells. In three main chapters, different approaches to this topic are presented and discussed: The first chapter focused on the simulation of several scenarios within cell-based assays. These simulations are all based on ...
Abstract (English)
This thesis provides a model study on the information content of multimodal impedance-based assays to assess the impact of microscale particles on cell physiology of mammalian cells. In three main chapters, different approaches to this topic are presented and discussed:
The first chapter focused on the simulation of several scenarios within cell-based assays. These simulations are all based on the so-called ECIS model, originally introduced by Giaever and Keese (1991), describing the impedance contribution of cell-covered gold-film electrodes. This theoretical part of the thesis should help to support the interpretation of impedance data. First, opening and closing of cell junctions (Rb) for different types of barrierforming cell layers were simulated and the accompanying changes in the complex impedance were extracted at various frequencies. The simulation data for some model epithelial and endothelial cell types showed that the relationship between resistance and barrier tightness may undergo inversion for frequencies above the cell-type specific threshold. Moreover, the influence of incomplete electrode coverage or inhomogeneity within the cell layer was studied systematically. For all experiments a good correlation between the simulated data and the experimental support was found.
The aim of the second project was to establish a new opto-electrical assay to investigate the dye transfer via gap junctions into neighboring cells. The principle of this new assay was based on loading a selected cell population with Lucifer Yellow by in situ electroporation. The cell-type specific adjustment of the ac pulse parameters for a temporary permeabilization of the plasma membrane improved the incorporation of Lucifer Yellow into the cytoplasm without affecting NRK cell viability. The assay also required the optimization of the gold-film electrode layout which enabled the application of the ac pulses, the non-invasive impedance recordings before and after pulse application and the microscopic analysis of dye transfer from cells on the electrode into adjacent cells. The final electrode layout (8W4E-GJ) contained four “semi-elliptical” electrodes which were separated by a photopolymer-free gap to facilitate microscopic analysis without any interference from the red autofluorescence of the photopolymer. The development of an appropriate experimental protocol yielded on electroporation in Ca2+-free buffer and the application of two sequential ac pulses, as it was found to enhance the uptake efficiency into primary-loaded NRK cells. The opto-electrical assay was successfully applied to analyze the effect of the well-known gap junctional intercellular communication inhibitor 2-APB. The analysis of dye transfer via gap junctions was based on confocal fluorescence micrographs documenting dye transfer from the electrode into the photopolymer-free gap. The analysis was further improved by the application of the red-fluorescent TRITC dextran as co-electroporated reference dye, which was trapped in the cytoplasm of primary-loaded cells due to its molecular size. The image
analysis of the position-dependent intensities of both dyes (TRITC dextran and Lucifer Yellow) allowed a quantification of gap junctional intercellular communication.
The third chapter contains all sub-projects dealing with a multimodal and label-free analysis of the impact of micrometer-sized silica particles (Ø = 2 μm) on vitality, migration, proliferation and gap junctional intercellular communication of adherent NRK cells in vitro. A sequence of different impedimetric assays, all based on the well-established ECIS technique, was applied for the analysis of particle impact on cell physiology. Microscopic
studies addressing the particle uptake revealed the presence of membrane-coated particles in the cytoplasm of NRK cells. Further evidence for particle uptake was gathered from ToFSIMS analysis that showed a densely-packed particle distribution around the cell nucleus in
cells with intact plasma membranes. Time-resolved ECIS measurements revealed no acute cytotoxicity of silica particles as well as no influence on cell migration. Furthermore, the influence of silica particles on NRK proliferation was studied impedimetrically. No differences
in the time-course of proliferation were found for particle-loaded or control cells. To study the influence of internalized particles on gap junctional intercellular communication the new optoelectrical assay was applied. Dye transfer to NRK cells in the periphery of the electrode was insignificantly different in absence and presence of silica particles. The results were supported by classical techniques, like FRAP analysis, scrape loading or parachute assay. Superior to other assays, the developed opto-electrical assay allowed for analysis of cell adhesion and cellular response to the presence of particle during an exposure time of 24 h prior to the dye transfer study. This enables the investigation of the impact of internalized particles on different cell-related parameters like viability, motility and gap junctional intercellular communication within one cell population.
Translation of the abstract (German)
Die vorliegende Arbeit ist eine Modellstudie, die unter Einsatz multimodaler, labelfreier impedanz-basierter Sensorik eine sequentielle Analyse des Einflusses von Mikropartikeln auf die Zellphysiologie von adhärenten Zellen ermöglicht. Die Studie gliedert sich in drei verschiedene Projekte. Im ersten Kapitel wurden Impedanzspektren unter Zuhilfenahme des bekannten ECIS Modells von Giaever und ...
Translation of the abstract (German)
Die vorliegende Arbeit ist eine Modellstudie, die unter Einsatz multimodaler, labelfreier impedanz-basierter Sensorik eine sequentielle Analyse des Einflusses von Mikropartikeln auf die Zellphysiologie von adhärenten Zellen ermöglicht. Die Studie gliedert sich in drei verschiedene Projekte.
Im ersten Kapitel wurden Impedanzspektren unter Zuhilfenahme des bekannten ECIS Modells von Giaever und Keese (1991) für verschiedenste experimentelle Szenarien
berechnet. Dies beinhaltete zum einen die Simulation einer konfluenten Zellschicht hinsichtlich der Fähigkeit, eine starke Zellbarriere auszubilden. Die Analyse der Impedanz und Widerstandsspektren für eine Zellpopulation mit unterschiedlich starken Zell-Zell Kontakten (Rb) zeigte ein frequenzabhängiges Verhalten des Widerstandes. Dadurch wird bei einer Analyse des Widerstandes bei Frequenzen oberhalb einer zelltyp-spezifischen kritischen Frequenz eine Zerstörung der Zell-Zell Kontakte gegen die Intuition durch einen Anstieg des Widerstandes angezeigt. Die präsentierten Simulationsergebnisse sollten helfen, Fehlinterpretationen vorzubeugen und die Analyse von ECIS Daten zu erleichtern. Im Folgenden wurde die Zellschicht, die im ECIS Model als homogene, konfluente Zellpopulation angenommen wird, gezielt verändert indem schrittweise die Inhomogenität innerhalb einer Population erhöht wurde. Dabei wurde systematisch analysiert, welchen Einfluss kleine zellfreie Bereiche oder Veränderungen innerhalb einer Population auf die komplexe Impedanz ausüben. Dies erfolgte durch Variation des Bedeckungsgrades der Elektrode mit Zellen, durch Etablierung einer Co-Population auf der Elektrode und der Veränderung von deren Membraneigenschaften oder von Zell-Zell-Kontakten.
Der zweite Teil der Arbeit beschäftigte sich mit der Entwicklung eines neuen optoelektrischen Assays zur Untersuchung der Gap Junction-vermittelten Zell-Zell-
Kommunikation (GJIC). Die Primärbeladung einer definierten Zellpopulation mit Lucifer Yellow basierte dabei auf dem Prinzip der in situ Elektroporation. Dazu wurden konfluente NRK Zellschichten auf Goldfilm-Elektroden etabliert und mittels optimierter Spannungspulse eine kurzzeitige Permeabilität der Zellmembran erzeugt. Dies ermöglichte den Eintrag von Lucifer Yellow in das Zytoplasma von NRK Zellen auf der Elektrode. Die Analyse der GJIC erfolgte mittels fluoreszenz-mikroskopischer Bilder anhand der Farbstoffweitergabe von Lucifer Yellow in benachbarte Zellen. Die Entwicklung des opto-elektrischen Assays erforderte eine Anpassung der Elektrodenstruktur. Das optimierte Layout bestand aus vier „halbelliptischen“ Goldelektroden, die durch einen Photopolymer-freien Spalt voneinander getrennt waren, der für die mikroskopische Analyse der GJIC herangezogen wurde. Das Elektrodenlayout dient dabei als Wachstumssubstrat für die Zellen, ermöglicht die Applikation von invasiven AC Pulsen, sowie eine nicht-invasive Impedanzanalyse vor und nach Pulsapplikation basierend auf dem ECIS Prinzip. Während der Entwicklung eines geeigneten Protokolls zur Durchführung des Assays zeigte sich, dass durch die Applikation von zwei aufeinander folgenden AC Pulsen die Primärbeladung mit Lucifer Yellow deutlich erhöht werden konnte. Die Analyse der mikroskopischen Bilder wurde durch den Einsatz des rot fluoreszierenden TRITC Dextrans als ko-elektroporierten Referenzfarbstoff erleichtert, der aufgrund seiner molekularen Größe ausschließlich im Zytoplasma der primär beladenen Zellen verbleibt. Mit Hilfe des opto-elektrische Assays konnte die Inhibierung der Farbstoffweitergabe von Lucifer Yellow in benachbarte NRK Zellen in Gegenwart des literaturkannten Hemmstoffes 2-APB erfolgreich nachzuweisen werden.
Das Ziel des dritten Projekts dieser Arbeit war, neben einer klassischen Untersuchung der durch Silikapartikel (d = 2 μm) ausgelösten Zytotoxizität, auch deren Einfluss auf
ausgesuchte, zellbiologische Fundamentalprozesse wie die Zellmigration, die Proliferation und die GJIC zu charakterisieren. Eine Beeinflussung dieser Grundprozesse würde eine Zelle nicht unmittelbar töten, sehr wohl aber ihre biologische Funktionalität erheblich einschränken und dennoch bei einer reinen Zytotoxizitätsbetrachtung der Beobachtung entgehen. Zur Korrelation der durch die Partikel ausgelösten Veränderungen von Migration,
Proliferation und Kommunikation mit der intrazellulären Partikelkonzentration wurde zudem die Partikelaufnahme in die Zellen untersucht und charakterisiert. Die Partikelaufnahme in das Zytoplasma von NRK Zellen wurde mittels lichtmikroskopischer Techniken unter Einsatz
klassischer zytochemischer Anfärbe Methoden adressiert. Eine intrazelluläre Lokalisation von Silikapartikeln wurde zusätzlich durch abbildende 3D Massenspektrometrie (ToF-SIMS), TEM- und REM-Studien ermöglicht. Nachdem weder nach einer Expositionszeit von 24 h noch bei Langzeitstudien über 72 h ein Hinweis auf zytotoxische Eigenschaften gefunden wurde, wurde der Einfluss von Silikapartikeln auf weitere zellphysiologische Parameter
untersucht. Zellmigration und Proliferation von NRK Zellen wurden unter Verwendung labelfreier impedimetrischer Untersuchungsmethoden zeitaufgelöst analysiert. Dabei zeigte sich kein Einfluss der internalisierten Partikel auf die Wundheilungseffizienz von NRK Zellen. Die Etablierung einer konfluenten Zellschicht erfolgte mit gleichen Proliferationskinetiken für NRK Kontrollpopulationen und Zellen in Anwesenheit der Partikel. Um den Einfluss internalisierter Partikel auf die GJIC unter den gleichen experimentellen Bedingungen erfassen zu können,
wurde der in Teil 2 entwickelte opto-elektrische Assay erfolgreich eingesetzt und mit vorangehenden, nicht invasiven Untersuchungen hinsichtlich der akuten Toxizität oder Motilität kombiniert. Die Quantifizierung des Farbstofftransports in benachbarte Zellen ergab keine signifikante Änderung der GJIC zwischen NRK Zellen unabhängig von der An- und Abwesenheit von Partikeln. Dieser Befund wurde zusätzlich mit klassischen Methoden, die zur Untersuchung von Zell-Zell-Kommunikation gerne eingesetzt werden, bestätigt.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 22:47
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