Modulation of TRPV1 function by phosphorylation and site-directed mutagenesis: from structure to biophysics

URN zum Zitieren dieses Dokuments:: urn:nbn:de:bvb:355-epub-340954
DOI zum Zitieren dieses Dokuments:: 10.5283/epub.34095

Jendryke, Thomas

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Veröffentlichungsdatum dieses Volltextes: 21 Jul 2016 07:31

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Dokumentenart:	Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation)
Open Access Art:	Primärpublikation
Datum:	21 Juli 2016
Begutachter (Erstgutachter):	Prof. Dr. C.H. Wetzel
Tag der Prüfung:	12 Juli 2016
Institutionen:	Medizin > Lehrstuhl für Psychiatrie und Psychotherapie > Molekulare Neurowissenschaften
Stichwörter / Keywords:	Zellbiologie, Elektrophysiologie, Whole-cell, single-channel, Pain, TRPV1, Cdk5,
Dewey-Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie
Status:	Veröffentlicht
Begutachtet:	Ja, diese Version wurde begutachtet
An der Universität Regensburg entstanden:	Ja
Dokumenten-ID:	34095

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Zusammenfassung (Deutsch)

Zusammenfassung (Deutsch)

Der TRPV1 Rezeptor ist ein polymodal aktivierbarer Kationenkanal, der eine besondere Rolle in der Nozizeption einnimmt. Es ist bekannt, dass die positive Modulation der TRPV1 Funktion durch Proteinkinase-vermittelte Phosphorylierungsprozesse zur Ausbildung von Hyperalgesie und/oder Allodynie beiträgt. Die vorliegende Studie hat das Ziel, die funktionellen Auswirkungen der Cdk5-vermittelten Phosphorylierung des TRPV1 Rezeptors an Position Threonin-406 aufzuklären. Mit Hilfe von elektrophysiologischen Messungen konnten wir zeigen, dass die Koexpression von TRPV1 und Cdk5 in CHO Zellen eine Ca2+-abhängige Desensitisierung des TRPV1 Ionenkanals verhindert. Um den Zusammenhang zwischen Struktur und Funktion der TRPV1 Phosphorylierung durch die Cdk5 zu untersuchen, haben wir verschiedene TRPV1T406 Mutanten erstellt, welche durch Einfügen negativ geladener Aminosäurereste die Cdk5-abhängige Phosphorylierung am Threonin-406 imitieren, oder diese durch Ersetzen des Threoninrests mit Alanin inhibieren. Mit Hilfe elektrophysiologischer Ganz-Zell und Einzelkanal Messungen, sowie mit Ca2+-imaging und TIRF Mikroskopie, haben wir die Funktion dieser TRPV1T406 Mutanten durch ihre Reaktion auf verschiedene Stimuli, wie Capsaicin, Hitze oder Protonen umfassend charakterisiert. Die Funktionsanalyse ergab, dass die Modifikation an Position T406 weitreichende Folgen für die Funktion des TRPV1 Ionenkanals haben kann. Das einbringen einer negativ geladenen Aminosäure, wie z.B. Asparaginsäure, veränderte die Ligandensensitivität, die Aktivierungs- und Desensitisierungskinetik sowie die Spannungsabhängigkeit des TRPV1 Ionenkanals. Die Einzelkanal Eigenschaften von TRPV1T406D Ionenkanälen zeigten ebenfalls deutliche Veränderungen, die auf einen veränderten Gating-Mechanismus des Rezeptors hindeuten. Unter Berücksichtigung der publizierten hochaufgelösten 3D Struktur des TRPV1 haben wir einen möglichen (mechanistischen) Übertragungsweg unter Beteiligung der Position 406 identifiziert und diesen Weg durch gezieltes Einbringen von Alanin-Resten und elektrophysiologischer Charakterisierung der TRPV1 Mutationen überprüft. Eine Störung des Übertragungsweges führte ebenfalls zu einer veränderten Funktion des TRPV1 Ionenkanals. Die Ergebnisse zeigen, dass die Position T406 des TRPV1 eine funktionelle Schlüsselrolle einnimmt und durch Phosphorylierung an der Modulation der Kanalfunktion beteiligt ist.

Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)

The TRPV1 receptor is a polymodally activated cation channel acting as key receptor in nociceptive neurons. Its function is modulated by kinase-mediated phosphorylation, which contributes to the development of hyperalgesia and allodynia. In the present study, we demonstrate that TRPV1 function is strongly modulated by the Cdk5-mediated phosphorylation at amino acid residue T406. We observed that co-expression of TRPV1 and Cdk5 prevents the Ca2+-dependent desensitization of the ion channel and has therefore severe consequences on receptor function. In order to understand the structural/functional consequences of TRPV1 phosphorylation in detail, we generated various TRPV1T406 receptor variants to mimic or inhibit the Cdk5-mediated phosphorylation. The function of these newly generated TRPV1T406 mutants was analyzed in a detailed characterization by means of electrophysiological whole-cell and single-channel experiments as well as Ca2+-imaging and TIRF microscopy. TRPV1-mediated currents were induced by challenging TRPV1 expressing CHO or HEK293 cells with capsaicin, low pH or heat. Our results revealed that the function of TRPV1 receptors highly depends on position T406. The introduction of negatively charged amino acids (Asp or Glu) modulates the ligand-sensitivity, activation and desensitization kinetics as well as the voltage-dependence of TRPV1. Moreover, the analysis of the single-channel properties of TRPV1WT and TRPV1T406D revealed that the introduction of Asp at position T406 alters the ion channel gating mechanism. In order to investigate this gating mechanism in detail, we considered the high resolution 3D structure of TRPV1 and found a potential transition pathway putatively involved in the mechanistic processes provoking a conformational change of the protein and leading to the opening of the channel pore. By mutating various amino acid residues lining this transition pathway and electrophysiological analysis of the recombinant receptors, we could show that the introduction of a negative charge at position T406 induces conformational changes in the TRPV1 linker domain which influence the gating mechanism of the TRPV1 receptor. Therefore, we conclude that the Cdk5-mediated phosphorylation of TRPV1 at position T406 is an important molecular switch that influences the TRPV1-mediated nociception.

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