| License: Publishing license for publications including print on demand (38MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-347832
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.34783
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 8 November 2016 |
| Referee: | Prof. Dr. Bernhard Weber |
| Date of exam: | 14 October 2016 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Humangenetik |
| Keywords: | Induzierte pluripotente Stammzellen; induced pluripotent stem cells; Entwicklung patientenspezifischer Zelllinien; development of Patient-specific cell lines; Erkrankungen des retinalen Pigmentepithels; Diseases of the Retinal Pigment Epithelium; RPE; hiPSC; hiPSC-abgeleitetes RPE; hiPSC-derived RPE; OCT4; SOX2; KLF4; L-Myc; Bestrophinopathien; Bestrophin-1; BEST-1; Reprogrammierung; Retinales Pigmentepithel; Institut für Humangenetik der Universität Regensburg; Lentivirus; Transduktion; transduction; Stammzellmarker; stemcellmarker; Differenzierung; VRACs; |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 34783 |
Abstract (German)
Neben multifaktoriell bedingten Erkrankungen des Retinalen Pigmentepithels (RPE), wie der altersbedingten Makuladegeneration, die in Deutschland die häufigste und weltweit eine der Hauptursachen von Erblindungen im Erwachsenenalter darstellt, führen auch eine Reihe monogenetisch bedingter Erkrankungen des RPE zu einem progredienten Verlust der Sehkraft. Bis dato gibt es nur begrenzte ...
Abstract (German)
Neben multifaktoriell bedingten Erkrankungen des Retinalen Pigmentepithels (RPE), wie der altersbedingten Makuladegeneration, die in Deutschland die häufigste und weltweit eine der Hauptursachen von Erblindungen im Erwachsenenalter darstellt, führen auch eine Reihe monogenetisch bedingter Erkrankungen des RPE zu einem progredienten Verlust der Sehkraft. Bis dato gibt es nur begrenzte therapeutische Optionen, da die molekulare Pathogenese dieser Erkrankungen oft noch unklar ist. Humane induzierte pluripotente Stammzellen (hiPSCs) gelten inzwischen als vielversprechende Möglichkeit in-vitro Modelle von Erkrankungen des RPE zu generieren, um die zu Grunde liegenden Ursachen näher beleuchten zu können.
Die im Folgenden beschriebene Studie lieferte als Basisprojekt wichtige Erkenntnisse für eine Arbeitsgruppe, die sich am Institut für Humangenetik der Universität Regensburg (UR) mit der Erforschung von hiPSCs und daraus abgeleiteten RPE-Zellen beschäftigt. Ziel der Arbeit war in erster Linie die Etablierung einer zuverlässigen Methode zur Erzeugung unversehrter hiPSC-abgeleiteter RPE-Zelllinien sowie deren ausführliche Charakterisierung. Während die Bedingungen für eine zuverlässige Differenzierung der hiPSCs zu daraus abgeleiteten RPE Zellen am Institut für Humangenetik der Universität Regensburg (UR) erst im Rahmen dieser Arbeit analysiert und festgelegt werden mussten, war ein verlässliches Protokoll für die Reprogrammierung von Fibroblasten zu hiPSCs dort bereits im Vorfeld etabliert worden. Es konnte die erfolgreiche Reprogrammierung adulter humaner dermaler Fibroblasten zu hiPSCs und deren Differenzierung in reines passagierbares RPE gezeigt werden. Die so erhaltenen Zellen waren sowohl strukturell als auch funktionell nativen RPE-Zellen sehr ähnlich.
Zunächst wurden hierfür Fibroblastenstämme aus Hautbiopsien von Kontrollpersonen und Patienten mit Mutationen im Bestrophin-1 (BEST1)-Gen gewonnen, welche für die autosomal dominante vitelliforme Makuladystrophie verantwortlich sind. Durch Transduktion mittels polyzystronischem Lentivirus und Überexpression der Faktoren OCT4, SOX2, KLF4 und L-Myc wurden die Fibroblasten zu hiPSCs reprogrammiert. Diese zeigten eine ähnliche Morphologie wie embryonale Stammzellen, wiesen auf RNA- und Proteinebene ein charakteristisches Stammzellmarkerprofil auf und besaßen chromosomale Integrität. Die nachfolgende Differenzierung lieferte hiPSC-abgeleitetes RPE, das einen pigmentierten hexagonalen Zellrasen bildete. Es war sowohl auf RNA- als auch auf Proteinebene mit nativem RPE vergleichbar. Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen zeigten hexagonale Zellen mit typischen apikalen Mikrovilli, während die hohen transepithelialen Widerstände für Zellintegrität sowie die Ausbildung eines funktionsfähigen apikalen Tight-Junction Komplexes sprachen. Zudem bestätigten Fütterungsexperimente mit Photorezeptoraußensegmenten (POS) eine intakte Phagozytosefähigkeit des hiPSC-abgeleiteten RPE. Darüber hinaus gelang es in dieser Arbeit sowie in späteren Experimenten an den hier erzeugten Zellen nachzuweisen, dass kryokonserviertes hiPSC-abgeleitetes RPE seine strukturelle und funktionelle Unversehrtheit weitgehend beibehält. Dies ist vor allem für die Generierung patienten- und krankheitsspezifischer Zellbanken von großer Bedeutung.
Es konnte somit gezeigt werden, dass dermale Fibroblasten als verlässliche Quelle zur Erzeugung von hiPSC-abgeleitetem RPE dienen, das in seinen strukturellen und funktionellen Eigenschaften humanem RPE gleicht.
Weiterhin lieferten Immunzytofärbungen die Erkenntnis, dass das Transmembranprotein BEST1 bei den hier generierten mutanten hiPSC-abgeleiteten RPE-Reihen im Vergleich zu Kontrolllinien nicht weitgehend an der basolateralen Plasmamembran, sondern zum großen Teil auch diffus im Zytoplasma der Zellen zu finden war.
Schließlich half das in dieser Arbeit erzeugte hiPSC-abgeleitete RPE in späteren Versuchen neue Erkenntnisse über die Rolle des Transmembranproteins BEST1 als volumenregulierter Chloridkanal und entscheidender Bestandteil volumenregulierter Anionenkanäle (volume regulated anion channels, VRACs) zu gewinnen und wird in Form kryokonservierter Zellbanken auch weiterhin für Versuche zur Verfügung stehen.
Die wesentlichen Ergebnisse dieser Dissertation wurden bereits in “In-Depth Characterization of Retinal Pigment Epithelium (RPE) Cells Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs)”, Brandl, Zimmermann et al. (2014) und “Bestrophin 1 is indispensable for volume regulation in human retinal pigment epithelium cells”, Milenkovic, Brandl et al. (2015) veröffentlicht.
Translation of the abstract (English)
Besides multifactorial diseases of the retinal pigment epithelium (RPE), such as age-related macular degeneration (AMD), which is the leading cause of blindness among adults in developed countries, a set of monogenic diseases leads to a progredient loss of vision. Up to now therapeutic options are very limited as the underlying pathomechanisms are often obscure. Human induced pluripotent stem ...
Translation of the abstract (English)
Besides multifactorial diseases of the retinal pigment epithelium (RPE), such as age-related macular degeneration (AMD), which is the leading cause of blindness among adults in developed countries, a set of monogenic diseases leads to a progredient loss of vision. Up to now therapeutic options are very limited as the underlying pathomechanisms are often obscure. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) are widely accepted as a promising tool to create patient and mutation specific in-vitro models of RPE in order to investigate the causative mechanisms.
The study provides a basis for a working group being engaged in research on hiPSCs and hiPSC-derived RPE cells at the Institute of Human Genetics at the University of Regensburg (UR). Target was to establish a reliable method of generating intact hiPSC-derived RPE cells as well as their in-depth characterization. While a reliable protocol for reprogramming fibroblasts to hiPSCs had already been established at the Institute of Human Genetics, UR, when starting this study in 2013, conditions for differentiation of hiPSCs into hiPSC-derived RPE cells still had to be analyzed and determined. Here successful reprogramming of adult human dermal fibroblasts to hiPSCs and their differentiation to pure expandable RPE cells, which resemble both structural and functional native human RPE cells, could be shown.
Therefore fibroblast cultures were gained from skin biopsy material of two healthy control persons and three patients with mutations in their Bestrophin-1 (BEST1)-gene. Following polycistronic lentiviral transduction with OCT4, SOX2, KLF4 and L-Myc those fibroblasts were reprogrammed into hiPSCs. These fibroblast-derived hiPSCs revealed morphology similar to human embryonic stem cells, a distinctive stem cell marker profile and chromosomal integrity. The following differentiation provided expendable hiPSC-derived RPE forming a pigmented monolayer. Both RNA and protein marker expression resembled mature human RPE. Scanning electron microscopy showed hexagonal hiPSC-derived RPE cells with typical microvilli at their apical sides, while high levels of transephithelial resistances proved cell integrity as well as functional apical tight-junction complexes. Moreover feeding of porcine photoreceptor outer segments revealed a proper phagocytotic ability of hiPSC-derived RPE cells. Furthermore in this study as well as in subsequent experiments with the generated cells it could be shown that hiPSC-derived RPE cells largely maintain structural and functional integrity after cryopreservation. Especially for generation of patient- and disease-specific cell banks this is of large interest.
Taken together it could be demonstrated that adult dermal fibroblasts can serve as a valuable resource for hiPSC-derived RPE cells resembling properties of native human RPE cells.
Immunolabelling exhibited that the transmembran protein BEST1 is not localized at the basolateral plasma membrane in mutant hiPSC-derived RPE cell lines compared to wildtype lines with a proper localization of BEST-1 at the basolateral plasma membrane.
Finally the generated hiPSC-derived RPE cell lines were supporting Milenkovic, Brandl et al. (2015) to gain insight into the role of BEST1 as a volume regulated chloride channel and a crucial component of volume regulated anion channels, VRACs. For further experiments the generated hiPSC-derived RPE-lines stay at disposal as cryopreserved cell banks.
Principal findings of the study have already been published in “In-Depth Characterization of Retinal Pigment Epithelium (RPE) Cells Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells (hiPSCs)”, Brandl, Zimmermann et al. (2014) and “Bestrophin 1 is indispensable for volume regulation in human retinal pigment epithelium cells”, Milenkovic, Brandl et al. (2015).
Metadata last modified: 25 Nov 2020 21:56
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