| License: Publishing license for publications excluding print on demand PDF - Submitted Version (18MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-348371
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.34837
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication | ||||||
| Date: | 22 November 2016 | ||||||
| Referee: | Prof. Dr. Joachim Wegener | ||||||
| Date of exam: | 4 March 2016 | ||||||
| Additional Information (public): | eBook: ISBN 978-3-319-45384-2, Hardcover: ISBN 978-3-319-45383-5 | ||||||
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik > Bioanalytik und Biosensorik (Prof. Joachim Wegener) | ||||||
| Identification Number: |
| ||||||
| Related URLs: |
| ||||||
| Keywords: | QCM, ECIS, cell-based assay, whole-cell biosensing, label-free, quartz crystal microbalance, impedance, adherent cells | ||||||
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences | ||||||
| Status: | Published | ||||||
| Refereed: | Yes, this version has been refereed | ||||||
| Created at the University of Regensburg: | Yes | ||||||
| Item ID: | 34837 |
Abstract (English)
Various approaches have been pursued on the basis of electrochemical or piezoelectric transducers, particularly of the quartz crystal microbalance (QCM), to monitor non-invasively and in real-time cellular states and reactions with substrate-embedded sensors. On the one hand, these comprised the technical development of piezoelectric sensors with multiple read-out spots and the integration of ...
Abstract (English)
Various approaches have been pursued on the basis of electrochemical or piezoelectric transducers, particularly of the quartz crystal microbalance (QCM), to monitor non-invasively and in real-time cellular states and reactions with substrate-embedded sensors. On the one hand, these comprised the technical development of piezoelectric sensors with multiple read-out spots and the integration of additional non-invasive (electro- and optochemical) sensor technologies on the QCM surface. On the other hand, a variety of studies and cell-based assays (CBAs) have been performed in order to test the sensor performances and to gain a deeper understanding of the sensors’ readout parameters with respect to their information content about the biophysical properties and the metabolic behavior of cells. Fig. 7–1 presents an overview of the different projects on the basis of QCM sensor disks presented in this thesis.
In the first project (Fig. 7–1 A) a novel electrode layout was designed on the basis of commercial 5 MHz AT-cut quartz disks to implement two independent readout spots on the QCM surface. This also comprised the construction of new measurement chambers for the electrical actuation and sensing of quartz oscillations. These two-electrode QCM sensors (2ElQ) are also referred to as multichannel QCM (MQCM).
The developed MQCM sensor spots on one quartz disk exhibited a strong interference, even though they were operated sequentially, which is in contrast to the results of previous theoretical calculations. The resonances could be successfully decoupled by coating half of the quartz surface and one sensor spot, respectively, with a thin and rigid film of photoresist. This quartz loading with mass caused a shift in the resonance spectra of the coated resonator to lower frequencies and efficient decoupling. The operation of the decoupled MQCM sensors demonstrated both, a sensitive and equal change in the oscillation characteristics of the two resonators upon loading of the quartz with medium. The Q-factor was not significantly different for the two resonators, qualifying the MQCM for its application in CBAs.
Building on the preceding development of the double-electrode quartz disks, a novel electrode layout has been realized at the sensor surface, which enables the complementary electrochemical (impedance spectroscopical) characterization of the substrate-liquid interface in addition to its mechanical characterization by the piezoelectric transducers (Fig. 7–1 B). This layout was achieved by removing a small area of the insulating photoresist on the coated electrode in the photolithographic process. By this, a coplanar electrode arrangement of a small working electrode and a bigger counter electrode was created. This sensor combination on the basis of the MQCM is an improvement of the so-called 2nd generation QCM to what we call the 3rd generation QCM, and which is also referred to as QCM-ECIS.
Various electrode layouts, varying in size and number of the working electrode(s), were fundamentally characterized microscopically and by profilometry regarding the geometrical properties and by means of impedance spectroscopy with respect to the sensing performances in QCM- and ECIS-mode. An optimal electrode layout was identified and defined as standard for subsequent applications in CBAs. In both QCM- and ECIS studies of cell-covered sensor surfaces significant changes in the characteristic sensing parameters with respect to the cell-free electrodes are measurable. In addition to the measurement of absolute signal changes, the transducer technologies of QCM and ECIS also enable to monitor the kinetic changes of the readout parameters with high temporal resolution. This allows to use the dual sensors for monitoring and analyzing the states of adherent cell cultures in any kind of assay, label-free, non-invasively, and in real-time.
Mechanical (QCM-mode) and the dielectric (ECIS-mode) characteristics of cell adhesion were simultaneously measured for two different cell lines (MDCK II and NRK), with high reproducibility for each. The total and kinetic parameter changes in both sensing modes distinguished clearly and were specific for the cell lines under test. The signals from both QCM-mode and ECIS-mode recordings also reported on significant impacts of the presence/ absence of bivalent cations (Ca2+, Mg2+) on the attachment and spreading kinetics and behavior of MDCK II cells. Aside from cell adhesion studies, the cytomechanical and cell morphological reactions towards various stimuli were monitored and analyzed by QCM-ECIS in a multitude of cellular assays: systematic softening and stiffening of cells (using agents for disassembling the actin cytoskeleton and cross-linking protein structures, respectively), intracellular stimulation (using a second messenger analogue), as well as electrical manipulation (electroporation (ELPO) and wounding) of cell layers (applying invasive voltage pulses). The applicability of electrical actuation and the subsequent non-invasive, time-resolved, and dual sensing with the electrodes of the QCM-ECIS substrates has been successfully demonstrated.
The monitoring of CBAs with the dual QCM-ECIS sensor chips developed in this thesis provides not only a multiplication of the information gain due to the complementarity of QCM and ECIS readout parameters. The simultaneous, time-resolved measurements also enable the kinetic correlation of the sensor signals in novel 2 D and 3 D diagrams, which offers the hitherto unprecedented opportunity for a more detailed view and analysis of the coherence or consecutiveness of mechanical and morphological/ dielectric changes of a cell layer under study.
A third research project focused on the combination of optical-chemical sensors (OCS) with the piezoelectric (QCM) sensor technology. For this purpose, the quartz crystal surface was coated with a polymer film with embedded phosphorescent indicator dye for the target analyte. The luminescence properties were measured by means of fluorescence (phosphorescence) lifetime imaging (FLIM).
By using a temperature-sensitive paint (TSP), an increase in temperature on the sensor surface upon high-amplitude oscillations was monitored and imaged this way in one project (Fig. 7–1 C). Based on this experimentally determined local heating on the QCM surface and the thereby generated temperature gradient in the liquid above the resonator, a thermophoretic convection in the fluid has been simulated. Theoretical considerations showed that the convection profile in the measurement vessel counteracts and even largely prevents the sedimentation of cells onto the sensor surface. It is suggested that the effect of thermophoresis is crucial especially in studies of biomolecular interactions on QCM surfaces at elevated shear amplitudes and driving voltages, respectively, which however has not been considered in literature to date.
The phosphorescence quenching capability of oxygen was utilized in a second imaging project to monitor and image the local concentration and distribution of oxygen on the growth substrate of cells by means of a so-called pressure(/oxygen)-sensitive paint (PSP) (Fig. 7–1 D). A home-made experimental setup was constructed for sensor calibration and the imaging of subcellular oxygen, consisting of a FLIM setup coupled to an upright microscope and a temperature- and oxygen-controlled calibration and measurement chamber suitable for cellular applications. The cytocompatible sensor films have been characterized under various test conditions (in air, under medium, at different temperatures) regarding their sensitivity and response characteristics to different oxygen partial pressures. The oxygen consumption of cells adherently grown on the sensor film was successfully monitored and imaged by this setup. The time-resolved measurements demonstrated a significantly faster consumption of oxygen of a cell layer stimulated with a respiration chain decoupler compared to an unstimulated control cell layer.
Taken together, various technical improvements of piezoelectric sensors (QCM) have been realized (MQCM, QCM-ECIS, ELPO-QCM-ECIS, QCM-OCS), which provide a significant information gain in cell-based applications. The sensors developed enable the high-content screening (HCS) of adherent cell lines in a wide range of assay formats and provide complementary physico-chemical information for obtaining a more complete picture of the state of cells and their reactions in contact to diverse stimuli. All sensor techniques share the characteristics of time-resolved, label-free, and non-invasive monitoring. This allows to disclose and analyze even the kinetics, delayed effects, recoveries, and fluctuations of physicochemical alterations of a studied cell layer, in addition to the absolute parameter changes, which is a valuable improvement compared to classical endpoint assays. The approach of combined, independent sensor systems also provides the novel possibility to bring parameters obtained by the different readout technologies from one cell layer in a temporal correlation, by which new insights into physiological relationships are possible.
Translation of the abstract (German)
Auf Basis von piezoelektrischen und elektrochemischen Signalwandlerprinzipien, im Speziellen der Quarzmikrowaagen-Technik (QCM), wurden verschiedene Ansätze verfolgt, um mittels in das Wachstumssubstrat integrierter Sensoren zelluläre Zustände und Reaktionen zeitaufgelöst und nicht-invasiv zu verfolgen. Diese umfassten zum Einen die technische Weiterentwicklung der bestehenden piezoelektrischen ...
Translation of the abstract (German)
Auf Basis von piezoelektrischen und elektrochemischen Signalwandlerprinzipien, im Speziellen der Quarzmikrowaagen-Technik (QCM), wurden verschiedene Ansätze verfolgt, um mittels in das Wachstumssubstrat integrierter Sensoren zelluläre Zustände und Reaktionen zeitaufgelöst und nicht-invasiv zu verfolgen. Diese umfassten zum Einen die technische Weiterentwicklung der bestehenden piezoelektrischen Sensorsysteme hinsichtlich Multiplizierung und Integration weiterer nicht-invasiver (elektrochemischer und optisch-chemischer) Sensortechnologien in die QCM-Oberfläche. Zum Anderen wurden zahlreiche Studien und zell-basierte Assays mit den entwickelten Systemen durchgeführt, um sowohl die Sensorperformance zu testen als auch ein tieferes Verständnis über die ausgelesenen Sensorparameter hinsichtlich deren Informationsgehalt über die biophysikalischen Eigenschaften und das metabolische Verhalten von Zellschichten zu erhalten. Fig. 7–1 gibt einen Überblick über die in dieser Arbeit vorgestellten Projekte.
In einem ersten Entwicklungsschritt wurde auf der Basis von kommerziell erhältlichen 5 MHz AT-cut Quarzplättchen ein neues Elektroden-Layout entworfen um zwei unabhängige Auslesespots auf der Quarzoberfläche zu generieren (Fig. 7–1 A). Dies beinhaltete auch die Konstruktion neuer Messkammern für die elektrische Kontaktierung der entsprechenden Elektrodenpaare auf dem Kristall. Diese Doppel-Elektroden QCM Sensoren (2ElQ) werden auch als “Multichannel QCM” (MQCM) bezeichnet.
Entgegen vorheriger theoretischer Berechnungen wiesen die entwickelten MQCM-Sensoren selbst bei sequenziellem Betrieb eine Interferenz auf. Durch Belackung einer Hälfte der Quarzoberfläche bzw. einer der beiden QCM-Spots mit einem dünnen und rigiden Polymerfilm gelang es, die Resonanzen zu entkoppeln. Diese Massenbeladung resultierte in einer Resonanzverschiebung des entsprechenden Oszillators hin zu kleineren Frequenzen und damit in einer effizienten Entkopplung. Das Betreiben der entkoppelten MQCM Sensoren zeigte, dass bei Beladung des Quarzes mit Medium beide Sensorspots sensitiv und in gleichem Ausmaß ihre Schwingungscharakteristik verändern. Der Qualitätsfaktor der beiden Oszillatoren kann als gleich angesehen werden, wodurch sich die MQCM-Sensoren für Anwendungen in zellbasierten Assays qualifizieren.
Aufbauend auf den entwickelten Doppel-Elektroden Quarzen wurde auf der Sensoroberfläche ein Elektrodenlayout verwirklicht, das neben der mechanischen Charakterisierung der Substrat-Medium Grenzfläche durch die piezoelektrischen Signalwandler eine zusätzliche, komplementäre elektro-chemische (impedanzspektroskopische) Charakterisierung ermöglicht (Fig. 7–1 B). Dieses Layout wurde durch das photolithographische Freilegen eines kleinen Bereiches der mit isolierendem Photopolymer beschichteten Elektrode erreicht. Hierdurch entsteht eine koplanare Anordnung aus einer kleinen Arbeitselektrode und einer größeren Gegenelektrode. Dieser kombinierte Ansatz auf Basis der MQCM ist eine Weiterentwicklung der 2. QCM-Generation zur 3. QCM-Generation und wird auch als “QCM-ECIS” bezeichnet.
Verschiedene Elektrodenlayouts, variierend in der Größe und Anzahl der Arbeitselektroden, wurden grundlegend charakterisiert, sowohl mikroskopisch und profilometrisch in der Abmessung der integrierten Arbeitselektrode, als auch impedanzspektroskopisch in deren sensorischen Leistungs-fähigkeiten im QCM- und ECIS-Modus. Basierend auf diesen Messungen wurde ein optimales Elektrodenlayout ermittelt und als Standard für nachfolgende Anwendungen in zellbasierten Assays definiert. Sowohl in den QCM- als auch in den ECIS-Messungen von mit tierischen Zellen bewachsenen Sensoroberflächen sind signifikante Messsignale gegenüber dem zellfreien Zustand detektierbar. Neben dem Messen absoluter Signale lassen sich mit beiden Technologien auch die kinetischen Änderungen charakteristischer Sensorparameter in hoher zeitlicher Auflösung verfolgen. Dies ermöglicht den Einsatz dieser dualen QCM-ECIS Sensoren für die markierungsfreie, nicht-invasive und zeitaufgelöste Überwachung und Zustandsanalyse von Zellschichten in allen erdenklichen Assays mit adhärenten Zellkulturen.
Es wurden simultan die mechanischen (QCM-Modus) als auch die dielektrischen (ECIS-Modus) Adhäsionscharakteristiken zweier unterschiedlicher Zelllinien (MDCK II und NRK) jeweils mit hoher Reproduzierbarkeit gemessen. Die dabei erhaltenen Absolutwerte und Kinetiken der Sensorparameter unterschieden sich signifikant und waren zelltyp-spezifisch. Die Signale aus Messungen im QCM- und ECIS-Modus zeigten auch deutliche Einflüsse der An-/ Abwesenheit bivalenter Kationen (Ca2+, Mg2+) auf die Kinetik und das Verhalten von Adhäsion und Spreitung von MDCK-II Zellen auf. Neben diesen Zelladhäsions-Untersuchungen wurden in einer Vielzahl zellulärer Assays die zytomechanischen und zellmorphologischen Reaktionen auf unterschiedliche Stimuli untersucht: systematisches Erweichen und Versteifen von Zellen (durch Agenzien, die das Aktin-Zytoskellet abbauen bzw. Proteinstrukturen quervernetzen), intrazelluläre Stimulation (mittels eines sekundären Botenstoff-Analogons), sowie gezielte elektrische Manipulation (Elektroporation (ELPO) und Verwundung) von Zellschichten (durch Applizieren invasiver Spannungspulse). Die Anwendbarkeit der elektrischen Aktorik und anschließender nicht-invasiver, zeitaufgelöster und dualer Sensorik mit den Elektroden der QCM-ECIS Substrate wurde erfolgreich demonstriert.
Das Überwachen zellbasierter Assays mit den in dieser Arbeit entwickelten dualen QCM-ECIS Sensor-chips führt nicht nur zu einer Multiplikation des Informationsgewinnes durch die Komplementarität der QCM- und ECIS- Ausleseparameter. Die simultanen, zeitaufgelösten Messungen ermöglichen darüber hinaus auch die kinetische Korrelation der Sensorsignale in neuartigen 2D- und 3D-Diagrammen, was bis dato noch nicht dagewesene Möglichkeiten zur Analyse kohärenter oder sequentieller mechanischer und morphologischer/ dielektrischer Änderungen der untersuchten Zellschichten bietet.
In einem dritten Forschungsschwerpunkt wurde die Kombination von optisch-chemischen Sensoren (OCS) mit den piezoelektrischen QCM Sensoren näher untersucht. Hierzu wurde die Quarzoberfläche mit einem Polymerfilm beschichtet, in dem ein phosphoreszierender Indikatorfarbstoff für den Zielanalyten eingebettet ist. Die Lumineszenzeigenschaft wurde mittels „fluorescence (phosphorescence) lifetime imaging” (FLIM) ausgelesen.
Mit Hilfe eines temperatursensitiven Anstriches (TSP) konnte in einem Projekt auf diese Weise die Erhöhung der Oberflächentemperatur auf dem Sensor, erzeugt durch Quarzoszillationen bei hoher Amplitude, überwacht und abgebildet werden (Fig. 7–1 C). Auf Basis dieser experimentell bestimmten lokalen Erwärmung auf der QCM Oberfläche und des daraus resultierenden Temperaturgradienten in der Flüssigkeit über dem Quarz wurde eine thermophoretische Konvektion in der Flüssigkeit simuliert. Theoretische Abschätzungen ergaben, dass dieses Konvektionsprofil der Sedimentation von Zellen auf die Sensoroberfläche entgegenwirkt und diese sogar weitgehend verhindert. Es wird angenommen, dass diese Thermophorese vor allem auch bei biomolekularen Interaktionsstudien auf QCM-Substraten bei erhöhten Scheramplituden einen maßgeblichen Einfluss hat, der jedoch bisher nicht in Betracht gezogen wurde.
In einem zweiten Imaging-Projekt (Fig. 7–1 D) wurde die Phosphoreszenzlöschungseigenschaft von Sauerstoff ausgenutzt, um mittels eines sauerstoffsensitiven Anstriches (PSP) auf dem Wachstums-substrat von Zellen die lokale Sauerstoffkonzentration und –verteilung bildgebend zu messen. Für die Kalibration der Sensorfilme und das subzelluläre Sauerstoff-Imaging wurde eigens ein experimenteller Aufbau, bestehend aus einer an ein Epifluoreszenzmikroskop gekoppelten Imaging-Apparatur und einer für Zellanwendungen geeigneten thermostatisierbaren und Sauerstoff-kontrollierten Kalibrations- und Messkammer, entwickelt. Die zytokompatiblen Polymerfilme wurden unter verschiedenen Test-bedingungen (an Luft, unter Medium, bei unterschiedlichen Temperaturen) hinsichtlich ihrer Sensitivität und dem Ansprechverhalten auf sich ändernde Sauerstoffpartialdrücke charakterisiert. Mit diesem Setup wurde erfolgreich der Sauerstoffverbrauch von auf dem Sensorfilm kultivierten adhärenten Zellen verfolgt und bildgebend gemessen. Die zeitaufgelösten Messungen zeigten einen signifikant schnelleren Sauerstoffverbrauch einer mit einem Atmungskettenentkoppler stimulierten Zellschicht im Vergleich zu einer nicht stimulierten Kontroll-Zellpopulation.
Zusammengefasst wurden verschiedene messtechnische Erweiterungen von piezoelektrischen Sensoren (QCM) erreicht (MQCM, QCM-ECIS, ELPO-QCM-ECIS, QCM-OCS), die erhebliche Zugewinne an Information in zellbasierten Anwendungen ermöglichen. Die entwickelten Sensoren machen ein multiparametrisches Screenen von adhärenten Zelllinien in vielzähligen Assayformaten möglich und liefern komplementäre physikochemische Informationen, um ein umfassenderes Bild über den Zustand von Zellen und deren Reaktionen auf unterschiedlichste Stimuli zu erhalten. Alle Sensorprinzipien teilen die Charakteristiken der zeitaufgelösten, label-freien und nicht-invasiven Messung. Dies erlaubt, im Gegensatz zu den klassischen Endpunktassays, neben absoluten Änderungen von Parametern auch die Kinetiken, verzögerte Effekte, Erholungen und Schwankungen in den Änderungen physikochemischer Eigenschaften der untersuchten Zellschichten aufzulösen und zu analysieren. Der Ansatz der Sensor-Kombination bietet zudem die neuartige Möglichkeit, die durch die verschiedenen Auslesetechniken von einer Zellpopulation erhaltenen Parameter in zeitliche Korrelation zu bringen, wodurch neue Einblicke in physiologische Zusammenhänge möglich sind.
Metadata last modified: 29 Sep 2021 07:40
Owner only: item control page
Download Statistics