| License: Publishing license for publications including print on demand (59MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-349791
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.34979
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 12 December 2017 |
| Referee: | Prof. Dr. Joachim Wegener |
| Date of exam: | 2 December 2016 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik > Bioanalytik und Biosensorik (Prof. Joachim Wegener) |
| Keywords: | impedance analysis, epithelial barrier function, TEER, permeability |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 34979 |
Abstract (English)
Dynamics and alterations of cellular barriers (epithelial or endothelial tissue) are studied in detail under physiological and pathological conditions in vitro. In order to do so, interfacial tissue is commonly cultured on permeable growth substrates to mimic in vivo like conditions. Impedimetric techniques (transfilter resistance measurements, electric cell substrate impedance sensing: ECIS) ...
Abstract (English)
Dynamics and alterations of cellular barriers (epithelial or endothelial tissue) are studied in detail under physiological and pathological conditions in vitro. In order to do so, interfacial tissue is commonly cultured on permeable growth substrates to mimic in vivo like conditions. Impedimetric techniques (transfilter resistance measurements, electric cell substrate impedance sensing: ECIS) serve as frequently used tool to monitor cellular barrier function since the readout can be performed in a label free and time resolved manner without any harmful side effects. The present study was focused on the development of new impedance based assay techniques to enhance the information content of measurements performed on epithelial cell monolayers.
One of the projects presented here was targeted on standardized TEER measurements (transepithelial or –endothelial electrical resistance). Usually, TEER serves as a measure for barrier function of filter grown cell monolayers. Since co cultured in vitro models mimic physiological situations far better than experiments on single cell layers, TEER is determined for co cultured cell layers too. However until today, only integrated signals, recorded for both cell layers cultured on either side of the porous growth substrate, are obtained. Alterations in cellular barrier function can not be attributed to one of both cell populations. In order to overcome these limitations, permeable electrodes were prepared from commercially available filter inserts.by depositing a thin gold film on the back side of the filter membrane. Integrated into the standard two electrode set up, the modified device offered the possibility to monitor both co cultured monolayers separately. As the normal transfilter measurement was still accessible, individual contributions of each cell type could be compared with the integrated signal. The new device was evaluated in cell attachment and spreading studies performed with homogeneous and heterogeneous co culture models. Additional proof of concept studies illustrated that the porous electrodes were capable of monitoring alterations in cellular barrier function for both populations separately. Independent TEER profiles were obtained for co cultured cell layers in cytoskeleton disassembly/reassembly assays. Furthermore, the electrode design of the device was modified. Dividing the bottom electrode into a small working electrode and a large counter electrode offered the possibility to apply the ECIS principle for cells cultured directly on the bottom of the chamber underneath an epithelial barrier. The extended four electrode set up was used to record impedance spectra and to determine all cell related parameters (TEER, Ccl) of co cultured cell layers on both sides of the porous electrode and an additional third cell layer simultaneously.
TEER is often determined to ensure cellular barrier integrity prior to other assay techniques like in vitro permeability assays. Permeability assays are routinely performed to characterize interfacial tissue by detecting the diffusion of a radio- or fluorescently labeled tracer compound across cell monolayers. The aim of the second project presented here was to design an impedance based device for combined recordings of substrate and ion permeation across confluent epithelial barriers. The simultaneous and automated permeability monitoring of monolayer resistance towards ions (TEER) and a permeability of a probe (Papp) was enabled by using a special electrode layout and a redox active tracer compound ([Fe(CN)6]3 /4 ). Two electrodes sandwiching the epithelial cell layer were used to record transcellular resistance while tracer diffusion across different cell monolayers was detected simultaneously by several electrodes, located underneath the filter membrane. The new device was used to calculate individual apparent permeability coefficients (Papp) which reflected local heterogeneities in cellular barrier function or defect areas within confluent cell layers. Compared to optical measurements which allow only for integrated permeability determination, the new automated assay technique was found to be superior regarding sensitivity, accuracy and handling.
Standardized in vitro cellular permeability assays still require a labeled tracer molecule. Fluorescent labeling of certain compounds is preferred over radiolabeled markers to reduce safety precautions. However, covalently coupled probes might alter the physicochemical properties of the tracer. Using unlabeled compounds is currently the best strategy for permeability assays but technical efforts are high since subsequent detection by chemical analysis is needed (e.g. liquid chromatography). The third project within this thesis aimed for the development of a new assay strategy which utilizes an impedance based readout to detect the permeation of unlabeled tracers across confluent cell layers without the need for chemical analysis. Therefore, a culture well with integrated and transparent ITO electrodes was fabricated. With these electrodes, ECIS like measurements were performed on adherently growing cell types (sensor cells) which endogenously express G protein coupled receptors (GPCRs). GPCR activation in response to the presence of an agonist used as permeability probe was followed via impedance monitoring. Unlabeled agonist permeation through intact cellular barriers was detected in a semi-quantitative manner by specific agonist receptor interactions on the sensor cell layers in the basal compartment of the assembled device. For proof of concept studies, two agonist receptor systems were tested here. Characteristic impedance patterns were observed depending on the sensor cell layer and the epithelial barrier under study. The sensor cell response was found to be related to the amount of substance which permeates across the epithelial barrier. The new impedance based readout detected the permeation of unlabeled endogenous receptor ligands in a reproducible manner. Semi-quantitative information about the permeability of the ligands under study was obtained without any coupled detection step.
Translation of the abstract (German)
Zahlreiche Studien befassen sich mit der Charakterisierung und der Dynamik Barriere bildender Zellschichten (Zellen der Haut, der Darm- oder Gefäßauskleidung). In vitro Modelle dienen dabei der detaillierten Untersuchung diverser Grenzflächengeweben unter physiologischen sowie pathologischen Bedingungen. In der Regel werden dafür immortalisierte Zelllinien, seltener auch primär isolierte Zellen, ...
Translation of the abstract (German)
Zahlreiche Studien befassen sich mit der Charakterisierung und der Dynamik Barriere bildender Zellschichten (Zellen der Haut, der Darm- oder Gefäßauskleidung). In vitro Modelle dienen dabei der detaillierten Untersuchung diverser Grenzflächengeweben unter physiologischen sowie pathologischen Bedingungen. In der Regel werden dafür immortalisierte Zelllinien, seltener auch primär isolierte Zellen, auf permeablen Substraten kultiviert, um deren biologische Anordnung als Grenzfläche zwischen zwei Kompartimenten unterschiedlicher Zusammensetzung nachzuempfinden. Als nicht invasive Techniken eignen sich impedanzspektroskopische Messmethoden besonders gut zur Untersuchung solcher Zellbarrieren. Widerstandsmessungen an zellbedeckten Filtermembranen können zeitliche Veränderungen der Barrierefunktion wiederspiegeln. Ebenso ist es möglich, adhärente Zellen direkt auf Filmelektroden zu kultivieren und deren Verhalten impedanzespektroskopisch zu analysieren (electric cell substrate impedance sensing: ECIS). Die hier vorliegende Studie widmete sich der Entwicklung neuer impedanzbasierter Testverfahren zur Untersuchung von Epithel- und Endothelzellen.
Eines der hier vorgestellten Projekte befasste sich mit der nicht-invasiven Quantifizierung der Permeabilität Barriere bildender Zellschichten gegenüber Ionen. Der transepitheliale / transendotheliale elektrische Widerstand (engl.: TEER) wird vorwiegend von zweidimensionalen Zellschichten bestimmt. TEER-Messungen an kokultivierten Zellschichten werden ebenfalls vermehrt durchgeführt, da derartige Modelle den in vivo Begebenheiten ähnlicher sind. Jedoch resultieren Widerstandmessungen an Kokulturen lediglich in der Detektion eines integrierten Messsignals. Durch das einseitige Aufbringen eines Goldfilmes auf Filtermembranen wurden hochpermeable Wachstumssubstrate dahingehend funktionalisiert, dass diese selbst als Elektrode dienen. Dadurch wurde es ermöglicht, Zellschichten auf beiden Seiten der Membran unabhängig voneinander impedimetrisch zu beobachten und einer quantitativen Analyse zugänglich zu machen. Davon uneingeschränkt konnten simultan auch klassische Transfiltermessungen durchgeführt werden. Das Konzept der Verwendung von porösen Elektroden als Transducer in impedimetrischen und zellbasierten Assays wurde durch Studien zum Adhäsions- und Spreitverhalten von mono- und kokultivierten Zellschichten validiert. Zusätzlich wurde gezeigt, dass permeable Elektroden eine detaillierte Effektanalytik kokultivierter Zellschichten auch unter dem Einfluss von Modeltoxinen ermöglichen. Für eine darauf aufbauende Anwendung wurde die Messkammer modifiziert. Durch die Separation der in die Messeinheit integrierten Bodenelektrode in zwei Elektroden unterschiedlicher Fläche wurde ein weitere Messmodus im unteren Filterkompartiment generiert (ECIS Modus). Die Verwendung permeabler Filterelektroden ermöglichte bei gleichzeitiger Anwendung des ECIS Prinzips die simultane, impedimetische Beobachtung und Quantifizierung der Kokultur auf der porösen Filtermembran und einer dritten Zellschicht am Boden der Messkammer.
TEER Bestimmungen werden routinemäßig durchgeführt um die Integrität diverser Zellschichten für nachgeschaltete Testverfahren zu garantieren. Dabei handelt es sich häufig um Diffusionsmessungen. Grenzflächengewebe wie Epithel- und Endothelzellen kontrollieren die passive Diffusion bestimmter Komponenten. Bei Diffusionsmessungen werden sowohl radiomarkierte als auch fluoreszierende Sondenmoleküle eingesetzt, welche die technischen Anforderungen solcher Methoden enorm erhöhen. Das zweite hier beschriebene Projekt befasste sich mit der kombinierten Detektion des transzellulären elektrischen Widerstandes einer Zellschicht und der Verfolgung der transzellulären Diffusion spezieller, redox-aktiver Sonden. Eine besondere Elektrodenanordnung ermöglichte die TEER Bestimmung während gleichzeitig die Permeation der Sonden durch Elektroden unterhalb des porösen Wachstumssubstrates aufgezeichnet wurde. Durch die Integration mehrerer kleiner Detektionspunkte konnte gezeigt werden, dass der Nachweis kleiner Defektstellen innerhalb der Zellschicht möglich ist. Die automatisierte und zeitaufgelöste Detektion der Sonden ermöglichte die Berechnung lokaler, apparenter Permeabilitätskoeffizienten. Dadurch gelang es lokale Schwankungen der Barrierefunktion konfluenter Zellschichten zu quantifizieren. Ein Vergleich mit optischen Detektionsmethoden verdeutlichte die Vorteile impedanzbasierter Permeabilitätsmessungen hinsichtlich Sensitivität, lokaler und zeitlicher Auflösung sowie experimenteller Durchführung.
Die Notwendigkeit markierter Sondenmoleküle lässt sich bei Permeabilitätsstudien nur durch nachgeschaltete Detektionsverfahren umgehen. Um die physikochemischen Eigenschaften diverser Verbindungen nicht durch die kovalente Kopplung an eine Fluorsezenssonde zu beeinflussen können unmarkierte Substanzen beispielsweise durch chromatographische Verfahren nachgewiesen werden. Um den technischen Aufwand solcher Tests zu verringern wurde im dritten hier beschriebenen Projekt eine impedanzbasierte Technik entwickelt, die es erlaubt das Permeationsverhalten unmarkierter Substanzen zu untersuchen. Auf der Grundlage des ECIS Prinzips wurden transparente Elektroden angefertigt. Als Elektrodenmaterial wurde dabei Indiumzinnoxid (ITO) verwendet. Derartige Elektroden wurden in Kulturgefäße integriert und dienten so als Substrat für adhärent wachsende Zellen. Für diesen impedanzbasierten Assay wurden beispielhaft Sensorzellen verwendet, welche G Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) endogen exprimieren. Über den Sensorzellen wurden permeable Filtermembranen platziert, auf welchen unterschiedliche, Barriere bildende Zellschichten kultiviert wurden. Der Messaufbau bestand somit aus einem 2 Kammern System. Die Diffusion unmarkierter Rezeptor Agonisten von der oberen Kammer in das nachgeschaltete Kompartiment hin zur Sensorzellschicht wurde daher durch eine zelluläre Barriere beeinflusst. Es konnte erfolgreich gezeigt werden dass sowohl das Ansprechverhalten der verwendeten Sensorzellen, als auch die Intensität charakteristischer Signalmuster in den hier untersuchten Ligand Rezeptor Systemen mit der Agonistkonzentration im unteren Kompartiment korrelierte. Anhand dieser Impedanzmuster konnten die Barriereeigenschaften der getesteten Grenzflächengewebe semi quantitativ eingeordnet werden. Der hier vorgestellte impedanzbasierte Assay ermöglicht daher die Untersuchung unmarkierter, endogener Substanzen im Hinblick auf ihr Permeabilitätsverhalten.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 21:49
Owner only: item control page
Download Statistics