![[img]](https://epub.uni-regensburg.de/style/images/fileicons/application_pdf.png) | License: Publishing license for publications including print on demand PDF - Published Version (10MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-352089
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.35208
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 14 February 2017 |
| Referee: | Prof. Dr. Karl Kunzelmann and Prof. Dr. Bernhard Weber and Prof. Dr. Ernst Tamm |
| Date of exam: | 21 December 2016 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Physiologie > Prof. Dr. Karl Kunzelmann |
| Keywords: | Anoctamin family, Volume regulation, RVD, VRAC, Cell proliferation, Apoptosis, Cancer, Innate immunity |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 500 Natural sciences & mathematics 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 35208 |
Abstract (English)
The family of anoctamins consists of ten different proteins (called ANO1-10 or TMEM16A-K). A variety of functions have been attributed to anoctamins such as that of Ca2+ activated Cl- channels controlling Cl- secretion, cell volume, cell migration and proliferation, and that of phospholipid scramblases contributing to apoptotic cell death. Some anoctamin members are overexpressed in tumors and ...
Abstract (English)
The family of anoctamins consists of ten different proteins (called ANO1-10 or TMEM16A-K). A variety of functions have been attributed to anoctamins such as that of Ca2+ activated Cl- channels controlling Cl- secretion, cell volume, cell migration and proliferation, and that of phospholipid scramblases contributing to apoptotic cell death. Some anoctamin members are overexpressed in tumors and have been linked to developmental defects. Mutations in anoctamins can cause genetic diseases and cancer. However, it is unknown how anoctamins fulfill these various functions.
Before ANO1 was identified as a protein forming a chloride channel, it was known as the cancer marker DOG1. DOG1/ANO1 is expressed in gastrointestinal stromal tumors (GIST) and particularly in head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC), and is not detected at very high levels in other tissues. We found that ANO1 strongly augments cell proliferation, cell migration and metastasis. We also found that ANO1 expression is controlled by histone deacetylases (HDAC), corresponding well to the known role of HDAC in HNSCC. As ANO1 did not enhance proliferation in every cell type, its function is perhaps modulated by cell-specific factors. In contrast to ANO1, we found that ANO6, by operating as a Ca2+ activated membrane phospholipid scramblase, supports cellular apoptosis and necroptosis rather than promoting proliferation.
Earlier findings from our laboratory and other groups indicated that ANO6 is a Cl- channel, a phospholipid scramblase and a nonselective cation channel activated by intracellular Ca2+ and pro-apoptotic stimuli. Moreover, previous studies characterized ANO6 as an outwardly rectifying Cl- channel (ORCC) and volume-regulated anion channel (VRAC) that is activated during apoptotic cell death. In the experiments presented here I found a major role of ANO6 for both regulatory volume decrease (RVD) as well as apoptotic volume decrease (AVD). RVD and AVD were examined in four different cell types under physiological conditions, i.e. in the presence of physiological intracellular and extracellular bath solutions and at 37 °C. Moreover swelling activated whole cell currents and volume regulation was assessed in freshly isolated intestinal epithelial cells from wild type and anoctamin 6 knockout mice. The data indicate that ANO6 generates a VRAC and is activated during RVD by membrane stretch, Ca2+ influx through TRP channels and activation of phospholipase A2 (PLA2), which generates membrane lysophospholipids (LPL). Accumulation of LPL in the plasma membrane enhances membrane tension, which possibly induces a conformational change of ANO6, thereby opening the Cl- conductive pore and causing RVD. Remarkably, RVD was largely reduced in intestinal epithelial cells from ANO6 knockout mice. The results also demonstrate that ANO6 is activated by low intracellular Cl-, which suggests that ANO6 operates as an osmosensor.
ANO6 was further demonstrated to participate in the innate immune response in macrophages. We could demonstrate that in macrophages Ca2+ influx through P2X7 channels leads to initial cell shrinkage, phospholipid scrambling, cell membrane blebbing and ultimately cell death. Cell migration and phagocytic activity was found to be largely reduced in Ano6-/- macrophages. We proposed that ANO6 plays a central role for the immune defense realized by macrophages. The data also indicate that P2X7-induced cell death in macrophages is due to activation of apoptosis as well as necrosis.
Another member of the anoctamin family, ANO10, was also demonstrated to be expressed in macrophages and to participate in innate immune response. In collaboration with the Max Planck institute of experimental Medicine in Göttingen we showed that the genomic ANO10 mutation R263H increases serum titers of antibodies directed against Lyme disease causing Borrelia. We suggest that ANO10-R263H enhances susceptibility towards Borrelia infection and attenuates clearance of spirochetes after tick bites. ANO10-R263H caused a reduced VRAC activity and RVD. Loss of ANO10 expression in macrophages compromised phagocytosis and clearance of Borrelia, attenuated volume regulation and reduced apoptotic cell death. Taken together the results demonstrate that anoctamins participate in the regulation of proliferation and cell death and play important roles in cancer and innate immune defense.
Translation of the abstract (German)
Die Anoctamin-Familie besteht aus zehn verschiedenen Proteinen (ANO1-10 oder TMEM16A-K). Inzwischen wurde den Anoctaminen eine Vielzahl von Funktionen zugeordnet. So bilden Anoctamine Ca2+-aktivierte Chloridkanäle, nehmen Einfluß auf das Zellvolumen, die Zellmigration und Zellproliferation und bilden Membranphospholipid-Scramblasen, womit sie einen Beitrag zum apoptotischen Zelltod leisten. ...
Translation of the abstract (German)
Die Anoctamin-Familie besteht aus zehn verschiedenen Proteinen (ANO1-10 oder TMEM16A-K). Inzwischen wurde den Anoctaminen eine Vielzahl von Funktionen zugeordnet. So bilden Anoctamine Ca2+-aktivierte Chloridkanäle, nehmen Einfluß auf das Zellvolumen, die Zellmigration und Zellproliferation und bilden Membranphospholipid-Scramblasen, womit sie einen Beitrag zum apoptotischen Zelltod leisten. Einige Anoctamine sind in Tumoren überexprimiert und werden mit Entwicklungsstörungen in Verbindung gebracht. Anoctamin-Mutationen können genetisch bedingte Krankheiten und Krebs verursachen. Es ist jedoch weitgehend unbekannt, wie Anoctamine diese verschiedenen Funktionen erfüllen.
Bevor Anoctamin 1 (ANO1) als Chloridionenkanal identifiziert wurde, war es als der Krebsmarker DOG1 bekannt. DOG1/ ANO1 ist in gastrointestinalen Stromatumoren (GIST) und vor allem in Weichteiltumoren des Kopfbereichs (HNSCC) derart hoch exprimiert, wie man dies in gesunden Geweben nie vorfindet. Wir fanden heraus, dass ANO1 die Zellproliferation, Zellmigration und Tumormetastasierung fördert. Wir fanden ebenfalls, dass die ANO1-Expression durch Histon-Deacetylasen (HDAC) kontrolliert wird. Dies korreliert sehr gut mit der bekannten Rolle von HDAC in Kopftumoren. Da ANO1 nicht in jedem Zelltyp die Proliferation stimuliert, ist anzunehmen, dass seine Funktion durch zellspezifische Faktoren moduliert wird. Im Gegensatz zu ANO1 fanden wir, dass ANO6 als Ca2+-aktivierte Plasmamembran-Phospholipidscramblase die zelluläre Apoptose und Nekroptose unterstützt, anstatt Proliferation zu fördern.
Ergebnisse aus unserem Labor und von anderen Arbeitsgruppen zeigen, dass ANO6 offensichtlich gleichzeitig ein Chloridionenkanal, eine Phospholipidscramblase und einen nichtselektiven Kationenkanal bildet und durch intrazelluläre Calciumionen und proapoptotische Stimuli aktiviert wird. Weiterhin kennzeichnen frühere Studien ANO6 als auswärts-gleichrichtenden Chloridionenkanal (ORCC) und als volumenregulierten Anionenkanal (VRAC). Diese Ionenkanalströme werden während des apoptotischen Zelltods aktiviert. In den hier vorgestellten Experimenten fand ich eine dominante Rolle von ANO6 sowohl für regulatorische Volumenabnahme (RVD), als auch für den apoptotischen Volumenverlust (AVD). RVD und AVD wurden in vier verschiedenen Zellarten unter physiologischen Bedingungen, d.h. in Gegenwart von physiologischen intra- und extrazellulären Ionenkonzentrationen und bei 37 ° C, untersucht. Darüber hinaus wurden Chloridionenströme und Volumenregulation in frisch isolierten Darmepithelzellen von Wildtyp-Mäusen und ANO6-Knockoutmäusen untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass ANO6 einen VRAC generiert und während RVD durch Dehnung der Plasmamembran, Ca2+ Einstrom durch Transient Receptor Potential (TRP)- Kanälen und Aktivierung von Phospholipase A2 (PLA2) aktiviert wird. PLA2 führt zur Bildung und Akkumulation von Lysophospholipiden (LPL) in der Plasmamembran, was zu einer Spannungsänderung innerhalb der Plasmamembran bewirkt und eine Konformationsänderung von ANO6 zur Folge hat. Diese Konformationsänderung induziert die Öffnung des ANO6-Kanals und die Aktivierung von RVD. Bemerkenswerterweise war die Kanalaktivierung und RVD in intestinalen Epithelzellen von ANO6-Knockoutmäusen deutlich reduziert. Weitere Ergebnisse zeigen, dass ANO6 durch eine niedrige intrazelluläre Chloridionenkonzentration aktiviert wird, was darauf hindeutet, dass ANO6 als Osmosensor funktioniert.
Weiterhin konnte eine Beteiligung von ANO6 bei der Immunreaktion in Makrophagen demonstriert werden. Wir konnten zeigen, dass in Makrophagen der Ca2+ Einstrom durch P2X7 Kanäle zur initialen Zellschrumpfung führt und danach Phospholipidscrambling, Zellmembran-Blebbing und schließlich Zelltod induziert wird. Die Zellmigration und Phagozytose-Aktivität war deutlich reduziert in Ano6-Knockout-Makrophagen. Hieraus schlossen wir, dass ANO6 eine zentrale Rolle bei der Immunabwehr durch Makrophagen spielt. Die Daten zeigen ebenfalls, dass der P2X7-induzierte Zelltod in Makrophagen durch gleichzeitige Aktivierung von Apoptose und Nekrose zustande kommt.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 21:35
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