| License: Creative Commons Attribution 4.0 (2MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-354617
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.35461
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 13 April 2017 |
| Referee: | Prof. Dr. Marina Kreutz |
| Date of exam: | 6 February 2017 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Innere Medizin III (Hämatologie und Internistische Onkologie) |
| Keywords: | 2-Hydroxyglutarat, 2-HG, dendritische Zellen, DC, Isozitratdehydrogenase, IDH |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 35461 |
Abstract (German)
Somatische Mutationen der Isozitratdehydrogenase (IDH) 1 und 2 wurden in verschiedenen Tumorentitäten nachgewiesen. Das mutierte Enzym IDH1/2 erlangte die Fähigkeit, α-Ketoglutarat in den Onkometaboliten 2-Hydroxyglutarat (2-HG) zu konvertieren. Bei der akuten myeloischen Leukämie (AML) ist bekannt, dass die Mutation der IDH1/2 positiv mit der Tumorprogression und einem schlechteren Outcome ...
Abstract (German)
Somatische Mutationen der Isozitratdehydrogenase (IDH) 1 und 2 wurden in verschiedenen Tumorentitäten nachgewiesen. Das mutierte Enzym IDH1/2 erlangte die Fähigkeit, α-Ketoglutarat in den Onkometaboliten 2-Hydroxyglutarat (2-HG) zu konvertieren. Bei der akuten myeloischen Leukämie (AML) ist bekannt, dass die Mutation der IDH1/2 positiv mit der Tumorprogression und einem schlechteren Outcome korreliert. Im Gegensatz dazu ist für Glioma WHO II und III und sekundäre Glioblastoma beschrieben, dass die Mutation mit einer guten Prognose korreliert. Auch beim Mamma Karzinom konnten erhöhte Level von 2-HG nachgewiesen werden, auch wenn keine Mutation der IDH vorlag und hier beeinflusste die Höhe des 2-HG-Levels die Prognose ebenfalls negativ.
Bisher wird angenommen, dass 2-HG vor allem zu epigenetischen Veränderungen führt und somit die Prognose der Patienten beeinflusst. Aufgrund der wichtigen Rolle von Immunzellen für die Tumorentstehung und -entwicklung, sollte im Rahmen der Arbeit der Effekt von 2-HG auf Immunzellen untersucht werden. Hierbei sollten insbesondere dendritische Zellen (DC) untersucht werden, da diese Antigen präsentierenden Zellen zum einen die Verbindung zwischen angeborener und adaptiver Immunität bilden und zum anderen essentiell sind für die Initiierung einer effektiven Anti-Tumor-Immunantwort. Vordaten der Arbeitsgruppe zeigten, dass 2-HG die Interleukin (IL)-12p70 Sekretion von DC signifikant hemmt. In der Arbeit sollte diese verminderte Sekretion bestätigt und der Mechanismus der Hemmung anhand verschiedener Parameter näher untersucht werden. Zudem sollte die Expression der Interleukin Untereinheiten p35 und p40 auf mRNA Ebene, sowie die Biosynthese der Untereinheiten des Interleukins unter Einfluss von 2-HG analysiert werden.
Da eine effektive Differenzierung der DC die Basis der DC Aktivität darstellt, sollten weitere mögliche Effekte auf die Differenzierung und Aktivierung der DC untersucht werden. In der Arbeit konnte gezeigt werden, dass das Dinatriumsalz von 2-HG spezifisch die IL-12p70 Produktion von LPS-aktivierten DC beeinflusst, jedoch keine Veränderung der Produktion anderer Zytokine bewirkt. Es zeigte sich zwar eine leichte Erhöhung der IL-10 Konzentration sowie eine leichte Reduktion der TNF Konzentration im Überstand der Zellen, diese Veränderungen waren jedoch nicht signifikant. Auch die Genexpression der IL-12p70 Untereinheiten p35 und p40 zeigte sich durch Na2-2-HG reduziert, jedoch ohne Signifikanz. Auf Proteinebene, mittels Durchflusszytometrie untersucht, führte Na2-2-HG zu einer Reduktion des IL-12p70-Dimers sowie zur Verminderung der p40 Untereinheit. Zur Verifizierung dieser Beobachtung sollten noch weitere Untersuchungen folgen. In der MLR schien sich ein leichter Effekt vor allem durch das L-Enantiomer von Na2-2-HG im Vergleich zur LPS-Kontrolle vorzuliegen, v.a. bei einer DC-Zellzahl von 5000 pro Well, da im Rahmen meiner Arbeit jedoch nur ein Versuch durchgeführt wurde, müssen weitere Versuche folgen. Bei der Untersuchung des Stoffwechsels der DC, wurden das Enzym Indolamin 2,3-Dioxigenase (IDO), die Atmung und die Laktatproduktion der Zellen unter Einfluss von Na2-2-HG analysiert. Die Untersuchung von IDO sowie der Laktatproduktion zeigten keinen Effekt von Na2-2-HG auf diese Stoffwechselwege. Die Untersuchung der Atmung der Zellen mittels PreSens ergab eine leichte Verstärkung der Atmung nach ca. drei Stunden, dieser Effekt war aber nur vorübergehend und sollte in weiteren Versuchen genauer untersucht werden. Um den Mechanismus der Beeinflussung des Zellmetabolismus durch Na2-2-HG genauer zu untersuchen, wurden erste Analysen von LPS-Signaltranduktionswegen mittels WesternBlot durchgeführt. Weder die Degradation von IκBα, noch dessen Phosphorylierung wurden hierbei durch Na2-2-HG beeinflusst. Auch bei der Untersuchung der MAPK Akt und p38 und deren Phosphorylierung konnte kein Effekt von Na2-2-HG festgestellt werden.
Da in dieser Arbeit der spezifische Effekt von Na2-2-HG auf die IL-12p70 Produktion in DC bestätigt werden konnte, bei den weiteren Untersuchungen sich jedoch nur bei der Zellatmung ein signifikanter Effekt durch den Metaboliten ergab, sollte in weiteren Experimenten der mögliche Zusammenhang zwischen beiden Effekten analysiert werden.
Translation of the abstract (English)
As you know, tumor metabolism is modified in many ways, for example the changes in the glucose metabolism, described with the warburg effect. It is known that a lot of lactate is produced by tumor cells. This is due to for example the upregulation of oncogenes and the loss of tumor suppressor genes. Furthermore, there are mutations in the succinate Dehydrogenase, fumarate hydrogenase and ...
Translation of the abstract (English)
As you know, tumor metabolism is modified in many ways, for example the changes in the glucose metabolism, described with the warburg effect. It is known that a lot of lactate is produced by tumor cells. This is due to for example the upregulation of oncogenes and the loss of tumor suppressor genes. Furthermore, there are mutations in the succinate Dehydrogenase, fumarate hydrogenase and isocitrate dehydrogenase (IDH), which are enzymes of the TCA cycle. One of these three enzymes, the IDH, is mutated in several cancers and associated with different overall survival. IDH mutations lead to production of L- and D-2Hydroxyglutarat (D-2HG). In tumor cells, IDH is often mutated. This is a gain of function mutation and the mutated IDH converts αKG to D-2HG. As there is no backreaction possible, D-2HG accumulates. Until now, there are some publications about effects of 2HG. But this is still under debate. The question now is: how does the 2HG affect on immune cells, especially dendritic cells (DC)? Last year the researching group startet to analyze effects of 2HG on immune cells. Cytokines secreation was measured by ELISA after 24h. we coud see that L- and D-HG lead to a reduction of IL-12 production in DC. The aim of the project is to analyze this effect of 2HG on DC more in detail. As a control we used metabolites involved in similar pathways: α-Ketoglutarate (aKG), Glutamic acid, Glutamic acid Natrium and Lactate. For activated DCs (mDC), it is known that the production of IL-12, IL-10, TNF, MCO-1 and IL-6 increases. Furthermore, the Antigenpresentation and Lactate production increase, but the respiration decreases in mDC. So, we investigated the effect of 2HG on LPS mDC and on the control metabolites. With LPS the production of IL-12 in DC increases a lot. With LPS and 2HG, doesnt matter which enantiomer, we see a significantly decreased production. We found also an significant effect of aKG, but there is a significant difference between 2HG and aKG. We also investigated the influence of 2HG on the production of other cytokines, but there was no significant effect of 2HG and also no effect of the controls on IL10, TNF, IL-6, MCP-1. Only Lactate lead to lower concentrations of the cytokines in the supernatant. Next we focused on the expression of Indolamin 2,3-Dioxygenase (IDO) in activated DC. IDO is upregulated in DCs after LPS. There was no effect of 2HG on IDO expression. As we know that DC are antigen presenting cells, we had a look at the Antigenpresentation in mDC treated with 2HG in a mixed lymphocyte reaction (MLR). Therefore we cultered mDC with naive Lymphozyte and the metabolites. As compared to mDC, the antigenpresentation of mDC with L-HG decreased, but there is no effect with D-HG. Therefore, more experiments are nessessairy to investigate this effect. Then we studied the effect of 2-HG on Lactate production and Respiration in mDC. It is known that the activation of DC with LPS induces lactate production. But there was no effect of 2-HG or of one of the controls on lactate production. As we found an effect of 2HG on IL-12 production in DC, we also checked, if there is an effect of metabolic modulators on IL-12 production. The first drug we focused on was Diclofenac. We measured the concentration of lactate in the supernatant. As expected before, with Diclo we found less lactate in the supernatant at different concentrations. In addition Diclofenac leads to a reduction of IL-12 but also TNF production as well as IL10 and MCP-1. This is different from 2HG which only reduces the IL-12 production. The next metabolic modulator we investigated, was Rotenon, a blocker of complex 1 in the respiration chain. we had a look at respiration in the preSense, which measures Oxygen use of the cells over 24h. Oxygen consumption of mDC is reduced in comparison to immature DC. Rotenon, as expectet before, lead to a strong inhibition of oxygen use. Then weh ad a look at 2HG. D-2HG had no additional effect on oxygen use as compared to LPS control. So The effect of 2HG on the IL12 production may not be related to an effect on respiration. In summary, we had a very specific effect of 2HG only on IL-12, no effect on IDO, and a slight effect on antigenpresentation in the MLR. Concerning the effect of 2HG on metabolism, we had no effect on lactate production and no effect on respiration. This is why we concentrated now on IL-12 and its subunits p35 and p40. Their encoding genes are Il-12A and IL-12B. Now we were interested in the regulation of these subunits on mRNA level and protein level which we analyzed by intracellular FACS staining. On mRNA level, there was a decreased expression of IL-12A by D- and L-2HG. We also had an effect with the control metabolites. The same is true for IL-12B. This is different from IL-12 production in the ELISA where we had a significantly stronger effect of 2HG as compared to aKG. Then we started to analyze the subunits of IL12 on protein level and the effect of 2HG on protein subunits. We treated the cells with monensin, a substance which blocks the transport of proteins in the golgi and therefore blocks the transport out of the cell. We found, that p35 is constitutive produced. After maturation, there were after incubation with LPS and Monensin, 17% double positive cells (p35 and p40). When we added D-2-HG, we saw that the amount of double positive cells was reduced compared to the mDC. Therefore, we suggest that there is an effect of D-2HG on the production of p40 in activated DC. Summerizing all the experiments, we had a specific effect of 2HG on IL-12 production in mDC and a significant effect on the respiration of the DC, but there was no other very specific effect of 2HG on DC. Therefore, more experiments will follow, to analyze the effect of 2HG on immune cells.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 21:27
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