| Lizenz: Creative Commons Namensnennung 4.0 International (5MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-355533
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.35553
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 12 April 2017 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Gunter Meister |
| Tag der Prüfung: | 15 März 2017 |
| Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Lehrstuhl für Biochemie I > Prof. Dr. Gunter Meister |
| Stichwörter / Keywords: | Dicer, Loquacious, Ago, Brat, Drosophila, Post-transcriptional gene regulation, FCCS, Single molecule pulldown |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 35553 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Die post-transkriptionelle Regulation spielt eine wichtige Rolle bei der Gen-Expression in Pro- und Eukaryoten und erlaubt eine rasche Anpassung an eine sich stets verändernde Umgebung. Dabei sind RNA-bindende Proteine von zentraler Bedeutung, indem sie mit der „messenger RNA“ (mRNA) interagieren und dabei ihre Reifung, Lokalisierung, Translation und ihren Abbau regulieren. Um ihre Ziel-Sequenzen ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Die post-transkriptionelle Regulation spielt eine wichtige Rolle bei der Gen-Expression in Pro- und Eukaryoten und erlaubt eine rasche Anpassung an eine sich stets verändernde Umgebung. Dabei sind RNA-bindende Proteine von zentraler Bedeutung, indem sie mit der „messenger RNA“ (mRNA) interagieren und dabei ihre Reifung, Lokalisierung, Translation und ihren Abbau regulieren. Um ihre Ziel-Sequenzen auf der mRNA erkennen zu können, treten sie entweder direkt in Kontakt mit der mRNA oder binden eine kurze Nukleinsäure-Sequenz in einer nicht kodierenden RNA, die in der Lage ist, mit der mRNA spezifische Watson-Crick Basenpaarungen auszubilden. Beispiele hierfür sind die so genannten microRNAs (miRNAs), „short-interfering“ RNAs (siRNAs) and „P-element-induced wimpy testis (Piwi)-interacting“ RNAs (piRNAs).
MiRNAs gehören zu einer Klasse von nicht kodierenden RNAs, die in vielen Lebewesen konserviert sind. Um eine reife miRNA zu erhalten, ist eine Reihe von verschiedenen Biogenese-Schritten notwendig. Das RNase III Enzym Dicer ist dabei von zentraler Bedeutung. Dicer bindet an ein doppelsträngiges RNA-Bindeprotein (dsRBP) und spaltet im Komplex mit diesem dsRBP die Haarnadel-förmige pre-miRNA sodass die reife miRNA gebildet wird. In dieser Arbeit wurde der Komplex aus Dicer-1 (dmDcr-1) und Loquacious (Loqs) aus der Fruchtfliege Drosophila melanogaster (Drosophila) untersucht. Dabei konnte die Kristallstruktur der dritten doppelsträngigen RNA-Bindedomäne (dsRBD) von Loquacious gelöst werden. Diese weist charakteristische Strukturelemente auf, die für die Bindung an dmDcr-1 verantwortlich sind. Zusätzlich wurde die nur in der Spleiß Variante Loquacious-PB vorkommende Region zwischen der zweiten und dritten dsRBD genauer untersucht, von der gezeigt wurde, dass sie einen starken Beitrag zur dmDcr-1-Bindung leistet. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass der Loqs-dmDcr-1 Komplex eine 1:1 Stöchiometrie aufweist, während die isolierte dsRBD3 dazu neigt, in Lösung Dimere auszubilden. Da wichtige Aminosäure-Reste, die für die Dimerisierung verantwortlich sind, in verschiedenen dsRBPs konserviert sind, ist davon auszugehen, dass die Dimerisierung ein wichtiger Bestandteil bei der post-transkriptionellen Genregulierung ist.
Nach der Prozessierung der pre-miRNA durch Dicer wird die reife miRNA an ein Protein aus der Argonaute (Ago) Familie übertragen. Ago besitzt bei der miRNA-vermittelten Genregulierung eine Schlüsselrolle. Die Regulation von Ago ist daher von zentraler Bedeutung für die Zelle. Aus massenspektrometrischen Untersuchungen wurden bereits viele mögliche Regulationsstellen, hauptsächlich Phosphorylierungen der Seitenketten von Ago wie z.B. an Aminosäureposition Y593 und S798, veröffentlicht. Um die Kinetik des Ago Beladungsprozesses genauer untersuchen zu können, wurde eine konfokale Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie Messmethode entwickelt, die es erlaubt, die Bindung einer Fluoreszenz-markierten dopplesträngigen siRNA an Ago zu beobachten. Dabei wurde zunächst die Bindung des siRNA-Duplex an GFP markiertes Ago1-4 gemessen. Zusätzlich wurde auch das Bindeverhalten von verschiedenen Ago Mutanten gemessen, die Informationen über die Bindung des 5‘ Endes der siRNA in die 5‘ Bindetasche von Ago geben konnten.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde das RNA-Bindeprotein „brain tumor“ (Brat) aus Drosophila strukturell charakterisiert. Brat gehört zu der Familie der „tripartite motif” (TRIM) Proteine und besitzt eine NHL-Domäne, die bereits strukturell aufgeklärt wurde und von der außerdem gezeigt wurde, dass sie für die direkte RNA-interaktion verantwortlich ist. Brat bindet an spezifische neuronale mRNAs, die den Selbsterneuerungsprozess von neuronalen Stammzellen steuern. Nach der Zellteilung werden die Brat assoziierten mRNAs in die Tochterzelle weitergegeben und steuert dort die Zelldifferenzierung. Die molekularen Details der Brat-mRNA Bindung waren jedoch bisher nicht bekannt. In dieser Arbeit konnte die Struktur der NHL-Domäne im Komplex mit einer RNA, die das Konsensus-Motiv 5‘-UUGUUG-3‘ enthielt, mit einer Auflösung von 2.3 Å bestimmt werden. Die Kristallstruktur zeigt wichtige Sequenz-spezifische Elemente der Protein-RNA Interaktion und klassifiziert den β-Propeller der NHL Domäne als ein weiteres Mitglied der stetig anwachsenden Familie der RNA-Bindeproteine.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Post-transcriptional gene regulation (PTGR) processes play a major role in eukaryotic and prokaryotic gene expression and mainly act on the mRNA level. Therefore, among other cellular processes, PTGR allows cells to react on constantly changing environmental influences, by the ability to rapidly adjust internal protein levels. As key players in such regulatory processes, RNA-binding proteins ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Post-transcriptional gene regulation (PTGR) processes play a major role in eukaryotic and prokaryotic gene expression and mainly act on the mRNA level. Therefore, among other cellular processes, PTGR allows cells to react on constantly changing environmental influences, by the ability to rapidly adjust internal protein levels. As key players in such regulatory processes, RNA-binding proteins (RBPs) interact with mRNAs to regulate their maturation, localization, translation and decay. Thereby RBPs can directly recognize their RNA target sequences via specific contacts with the RNA bases, for example. In other cases, the RBP binds to a short fragment of nucleic acids, which guides the RBP-RNA complex to a complementary target sequence via Watson-Crick base pairing with the target RNA. Examples for such RNA guides are microRNAs (miRNAs), short-interfering RNAs (siRNAs) and P-element-induced wimpy testis (Piwi)-interacting RNAs (piRNAs).
MiRNAs represent a class of small non-coding RNAs (ncRNAs), which are highly conserved in biogenesis and function among eukaryotes. After processing of the miRNA from double stranded precursors, by a variety of different proteins, including the RNase III enzyme Dicer and its double-stranded RNA binding protein (dsRBP) partners, mature miRNAs assemble with Argonaute (Ago) proteins into so called miRNA-induced silencing complexes (miRISCs). In this study, the processing of the Drosophila melanogaster (Drosophila) Dicer-1 (dmDcr-1) in complex with its dsRBP partner Loquacious (Loqs) has been structurally and functionally investigated. Loqs contains three different dsRBDs and the crystal structure of the third dsRNA binding domain (dsRBD) reveals specific structural elements that are responsible for the interaction with dmDcr-1 and a linker preceding the dsRBD3 strongly enhances the affinity of the binding. Furthermore, the Loqs-dmDcr-1 complex revealed a 1 to 1 stoichiometry identified by single molecule spectroscopy but formed dimers in the absence of dmDcr-1. In consideration of the conservation of critical sequence elements, it is likely that dimerization might comprise a general feature of dsRBPs in gene silencing.
Ago proteins, as protein-binding partners of miRNAs, are key players in miRNA-mediated gene-silencing processes. For their correct function, they require a strict regulation that is supposed to be mainly achieved by phosphorylation of specific residues within the sequence of Ago proteins. In mass spectrometry (MS) screens, several potential regulatory sites have been reported in literature, for example Y593 and S798 within the sequence of Ago2. To be able to investigate the kinetical details behind Ago-loading processes of wildtype (wt) and mutant Ago proteins, a confocal fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) assay was established. Thereby, the binding of a fluorescently labeled siRNA duplex to GFP-tagged Ago1-4 and respective mutants was investigated. Furthermore kinetic data from different mutations of the potential post-translational regulatory phospho-sites was measured, providing information on the binding of a siRNA 5’ end within the 5’ binding pocket. Furthermore, the established FCCS assay provides a valuable tool for the future analysis of any mutation within the sequence of an Ago protein and its influence on Ago-loading processes.
In the second part of this thesis, the Drosophila RBP brain tumor (Brat), which belongs to the conserved NHL-domain containing tripartite motif (TRIM) protein family, has been structurally characterized. Brat is responsible for the differentiation of neuronal stem cells by repressing the expression of self-renewal factors. Thereby, Brat directly contacts a specific target sequence motif on mRNAs, coding for self-renewal factors and is supposed to function as a translational repressor. The molecular details for the interaction of Brat with its RNA targets, however, were unknown. Therefore, the crystal structure of the Brat NHL-domain in complex with its consensus target sequence has been solved at 2.3 Å resolution. The high resolution protein-RNA structure reveals several features of sequence-specific substrate contacts of the Brat-NHL domain to its consensus RNA motif, adding the β-propeller fold as a novel member to the growing family of RBDs.
Metadaten zuletzt geändert: 25 Nov 2020 21:24
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