| License: Publishing license for publications excluding print on demand PDF - Published Version (62MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-355964
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.35596
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 3 May 2017 |
| Referee: | Prof. Dr. Reinhard Sterner |
| Date of exam: | 28 April 2017 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Reinhard Sterner |
| Keywords: | enzyme evolution, Enzymevolution, protein evolution, Proteinevolution, superfamilies, Superfamilien, chorismate-utilizing enzymes, Chorismat-umsetzende Enzyme, ancestral sequence reconstruction, Rekonstruktion anzestraler Sequenzen, bi-functionality, Bifunktionalität, enzyme catalysis, Enzymkatalyse, nucleophile specificity, Nukleophilspezifität, enzyme channels, Tunnel in Enzymen, protein-protein interactions, Protein-Protein Interaktionen, protein interfaces, Proteinkontaktflächen, protein structure, Proteinstruktur |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 35596 |
Abstract (English)
Superfamilies are a classification system to combine proteins that are related through a common evolutionary origin, share similar sequences, structures, and core reaction mechanisms, but exert different functions. Today, for most superfamilies tens of thousands of sequences and hundreds of structures are known and most of the different functions of their members have been elucidated. ...
Abstract (English)
Superfamilies are a classification system to combine proteins that are related through a common evolutionary origin, share similar sequences, structures, and core reaction mechanisms, but exert different functions. Today, for most superfamilies tens of thousands of sequences and hundreds of structures are known and most of the different functions of their members have been elucidated. Superfamilies thus provide a formal and biologically sensible framework to study evolutionary relationships between proteins. In the present work, the frameworks of three enzyme superfamilies were utilized to get insights into several important aspects of enzyme evolution.
The first part of this work addresses the question how enzymatic mono- and bi-functionality have evolved in the superfamily of ribose-binding (βα)8-barrel sugar isomerases. This superfamily contains the homologous enzymes HisA and TrpF, which catalyze similar reactions in histidine and tryptophan biosynthesis, as well as the bi-functional enzyme PriA, which catalyzes both the HisA and TrpF isomerization reactions. HisA and TrpF are ubiquitous in Archaea and Bacteria, whereas PriA is only found in certain Actinobacteria. These species have lost the dedicated TrpF enzyme and PriA is consequently part of both tryptophan and histidine biosynthesis. Much has been speculated on the evolutionary relationship of these enzymes and whether the bi-functionality of PriA is a remnant from ancient evolutionary times or a more recent development in Actinobacteria. Using ancestral sequence reconstruction it was demonstrated in this work that evolutionary ancestors of modern HisA enzymes display bi-functionality, reminiscent of PriA. A detailed enzymatic characterization of three reconstructed HisA ancestors showed that they catalyze not only the HisA but also the TrpF reaction with comparable catalytic efficiencies in vitro. Metabolic complementation experiments with hisA and trpF deficient Escherichia coli strains furthermore demonstrated that the bi-functional HisA ancestors could support both histidine and tryptophan biosynthesis in vivo. By a combination of sequence- and network-based in silicomethods, several modern HisA enzymes were subsequently identified that possess sequence motifs typical for bi-functional PriA enzymes. The enzymatic characterization of three such modern HisA representatives revealed that they are also bi-functional, albeit to a lesser extent, although the respective organisms possess dedicated TrpF enzymes. Thus, the ancestral bi-functionality has pertained for billions of years in HisA enzymes, without any obvious selective pressure. Consequently, a new model for the evolution of HisA, TrpF, and PriA was proposed: The bi-functionality of ancient HisA variants may have played an important role in maintaining early metabolism by supporting both histidine and tryptophan biosynthesis. After the emergence of dedicated TrpF enzymes the bi-functionality of the ancestors became expendable and diminished to the level observed in modern HisA enzymes. However, the inherent bi-functionality of HisA contributed to the robustness of microbial metabolism and made possible to compensate the loss of a dedicated trpF gene in some Actinobacteria. In these organisms, the available bi-functionality of HisA was exploited, selected for, and enhanced, which eventually led to the modern PriA enzymes.
The second part of this work deals with the evolution of substrate specificity and secondary metabolic enzymes in a superfamily of chorismate-utilizing enzymes, named MST-superfamily. Chorismate is a central metabolic node molecule and the starting point for the biosynthesis of various important metabolites, including aromatic amino acids, folate, or iron-chelating siderophores. The MST-enzymes catalyze the committed steps of these biosynthetic pathways and are highly similar in sequence, structure, and reaction mechanism. However, the MST-enzymes that are part of primary metabolic pathways employ exclusively ammonia as a nucleophile to aminate chorismate, whereas those that are part of secondary metabolic pathways exclusively employ water as a nucleophile to hydroxylate chorismate. Based on the notion that secondary metabolic enzymes are descendants of primary metabolic ones, it was investigated in this part of this work by which mechanism the transition from primary metabolic to secondary metabolic MSTenzymes went along with a change in nucleophile-specificity from ammonia to water. Initially, network-based, phylogenetic, and structure-based in silicomethods were applied to identify two key amino acids in the nucleophile access channel of the active site that distinguish primary-metabolic/ammonia-utilizing and secondary-metabolic/water-utilizing MST-enzymes. The importance of these key positions was subsequently examined by rationally designing sixteen variants of the MST-enzyme anthranilate synthase, which normally employs ammonia as a nucleophile. The enzymatic characterization of these variants by HPLC-MS showed that the right combination of amino acids at the two key positions indeed resulted in a broadening of nucleophile specificity to also include water. These anthranilate synthase variants hydroxylated chorismate and formed isochorismate with efficiencies comparable to native secondary-metabolic/water-utilizing isochorismate synthases. Moreover, these variants were still able to employ ammonia as a nucleophile and formed their native product anthranilate; hence they were bi-functional. These experiments demonstrated that nucleophile specificity in the MST-superfamily can readily switch from ammonia to water. Moreover, the observed bi-functionality of the anthranilate synthase variants argues that the evolution of secondary metabolic MST-enzymes may have proceeded through bi-functional intermediates. Such metabolic generalists may have allowed for the formation of novel metabolites (isochorismate) while maintaining the formation of important primary metabolic metabolites (anthranilate). This scenario consequently does not a priorirequire gene duplication events and thus precludes negative metabolic effects linked to retaining redundant gene copies.
The third part of this work pursues the question how protein-protein interaction specificity is assured in superfamilies of structurally related protein complexes and how the determinants of interaction specificity have evolved. Specific interactions between proteins are vital for almost all cellular functions. This specificity is usually achieved by shape and electrostatic complementarity of protein interfaces. However, the number of different protein folds and interface geometries found in Nature is limited, due to the constraints imposed by efficiently packing hydrogen-bonded secondary structure elements. It is thus a challenging question how interaction specificity is achieved despite structural limitations and how the formation of non-physiological complexes is avoided when several possible interaction partners with similar interface geometries are available. In order to address this problem, initially a comprehensive computational survey of the interface geometries of over 300 bacterial, heteromeric protein complexes and all their homologs of respective superfamilies was performed. This survey revealed that in about 10% of the superfamilies interface geometries vary significantly between related complexes that share homologous subunits. In these cases interfaces were extended by socalled interface add-ons, which typically comprise 10-20 amino acids, form well-defined secondary structure elements, and significantly contribute to complex stability. These characteristics suggested that interface add-ons differentiate between structurally related protein complexes and contribute to interaction specificity through negative design. In order to back this assumption, the case of the interface add-on found in a superfamily of glutamine amidotransferase complexes involved in tryptophan and folate biosynthesis was subsequently analyzed in detail. These complexes comprise synthase and glutaminase subunits that interact to transfer ammonia from glutamine to an acceptor substrate. A subset of synthase subunits exclusively involved in tryptophan biosynthesis contains the interface add-on, whereas it is absent in all other homologous synthase subunits, including those exclusively involved in folate biosynthesis. The comprehensive experimental characterization of 54 combinations of different synthase and glutaminase subunits by chromatographic methods, light scattering, mass spectrometry, and enzyme kinetics demonstrated that the presence or absence of the interface add-on determines interaction specificity. An in silicogenetic profiling of over 15000 archaeal and bacterial genomes together with in vivogrowth assays showed that the interface add-on found in complexes of tryptophan biosynthesis is biologically relevant for preventing cross-interactions with the homologous complexes of folate biosynthesis, which would lead to harmful metabolic cross-talk that negatively affects cellular fitness. It was finally shown by protein design that the evolution of the interface add-on in these complexes most likely proceeded via intermediary complexes with relaxed interaction specificity. In conclusion, this part of this work demonstrates that interface add-ons are evolutionary tools to facilitate interaction specificity in superfamilies of homologous proteins or in cases where a protein has to discriminate between several potential interaction partners that share similar interface geometries.
In summary, the presented work leads to an improved understanding of the mechanisms behind the evolution of enzymatic mono- and bi-functionality, emphasizes the importance of generalist, bi- or multi-functional enzymes for the evolution of secondary metabolic pathways, and finally describes a so far overlooked structural tool for the evolutionary specification of protein-protein interactions.
Translation of the abstract (German)
Superfamilien stellen ein Klassifikationsschema zur Gruppierung von Proteinen dar, die auf einen gemeinsamen evolutionären Ursprung zurück gehen und Ähnlichkeiten in Sequenz, Struktur und Reaktionsmechanismus besitzen, jedoch unterschiedliche Funktionen ausüben. Die meisten Superfamilien sind heute umfassend charakterisiert und häufig sind für eine Superfamilie mehr als zehntausend Sequenzen, ...
Translation of the abstract (German)
Superfamilien stellen ein Klassifikationsschema zur Gruppierung von Proteinen dar, die auf einen gemeinsamen evolutionären Ursprung zurück gehen und Ähnlichkeiten in Sequenz, Struktur und Reaktionsmechanismus besitzen, jedoch unterschiedliche Funktionen ausüben. Die meisten Superfamilien sind heute umfassend charakterisiert und häufig sind für eine Superfamilie mehr als zehntausend Sequenzen, mehrere hundert Strukturen sowie die zentralen Funktionen bekannt. Superfamilien erlauben daher als formales und gleichzeitig biologisch sinnvolles Rahmenwerk die Untersuchung der evolutionären Zusammenhänge zwischen Proteinen. Für die vorliegende Arbeit wurden drei Enzym-Superfamilien herangezogen, um Einblicke in mehrere wichtige Fragestellungen der Evolution von Enzymen zu gewinnen.
Der erste Teil dieser Arbeit befasst sich mit der Evolution enzymatischer Mono- und Bifunktionalität in der Superfamilie der Ribose-bindenden Zuckerisomerasen mit (βα8)Fass Struktur. Diese Superfamilie enthält unter anderem die verwandten Enzyme HisA und TrpF, die ähnliche Reaktionen in der Biosynthese der Aminosäuren Histidin und Tryptophan katalysieren. Zusätzlich enthält die Familie auch das bifunktionale Enzym PriA, welches sowohl die HisA, als auch die TrpF Isomerisierungsreaktion katalysiert. Während HisA und TrpF in den meisten Archaeen und Bakterien vorkommen, ist PriA ausschließlich in bestimmten Actinobakterien zu finden. Diesen Spezies fehlt ein dediziertes TrpF Enzym und PriA ist daher essentiell für die Biosynthese sowohl von Histidin als auch von Tryptophan. Es wurden bisher mehrere Hypothesen über die genauen evolutionären Zusammenhänge dieser drei Enzyme aufgestellt; so auch beispielsweise ob die in PriA beobachtete Bifunktionalität ein Überrest von evolutionsgeschichtlich alten Enzymen ist oder ob sie sich erst in neuerer Zeit speziell in Actinobakterien entwickelt hat. Anhand der Rekonstruktion anzestraler Proteinsequenzen wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass die evolutionären Vorfahren moderner HisA Enzyme eine zu PriA ähnliche Bifunktionalität aufweisen. Die genaue enzymatische Charakterisierung dreier HisA-Vorläufer ergab, dass diese nicht nur die HisA-Reaktion, sondern auch die TrpF-Reaktion in vitromit vergleichbarer Effizienz katalyiseren. Mittels metabolischer Komplementationsexperimente wurde weiterhin gezeigt, dass die bifunktionalen HisA-Vorläufer in vivodie Aufrechterhaltung von Histidin- und Tryptophanbiosynthese ermöglichen. Darauf aufbauend wurden mittels einer Kombination aus sequenz- und netzwerkbasierten in silicoMethoden mehrere moderne HisA Enzyme identifiziert, die Sequenzmotive enthalten, die für bifunktionale PriA Enzyme typisch sind. Die enzymatische Charakterisierung dreier solcher HisA Vertreter zeigte, dass diese ebenfalls einen gewissen Grad an Bifunktionalität aufweisen. Interessanterweise besitzen die zugehörigen bakteriellen Spezies jedoch eigenständige TrpF Enzyme. Die ursprüngliche Bifunktionalität von HisA hat sich folglich über mehrere Milliarden Jahre erhalten; offenbar ohne direkten Selektionsdruck oder evolutionären Vorteil. Aufbauend auf diesen Ergebnissen wurde abschließend ein neues Modell zur Erklärung der Evolution von HisA, TrpF und PriA vorgeschlagen: In der evolutionären Frühzeit waren bifunktionale HisA Varianten vermutlich wichtig für die Aufrechterhaltung einer primitiven Art von Metabolismus, da sie sowohl die entscheidende Isomerisierungsreaktion in der Histidinbiosynthese, als auch die analoge Reaktion in der Tryptophanbiosynthese katalysieren konnten. Nachdem im Laufe der Evolution allerdings für letztere Reaktion dedizierte TrpF Enzyme entstanden waren, führte ein geringerer Selektionsdruck auf HisA zu einer Abnahme der Bifunktionalität auf das Niveau moderner HisA Vertreter. Dennoch spielte die den HisA Enzymen eigene Bifunktionalität eine wichtige evolutionäre Rolle, da sie die Anpassungsfähigkeit des bakteriellen Metabolismus vergrößerte. So ermöglichten bifunktionale HisA Varianten beispielsweise den Verlust eines dedizierten TrpF Enzyms in Actinobakterien auszugleichen. In diesen Organismen wurde die HisA Bifunktionalität in Folge durch Selektion verstärkt, woraus letztendlich die modernen, bifunktionalen PriA Enzyme hervorgingen.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Evolution von Substratspezifität und sekundärmetabolischen Enzymen am Beispiel einer Superfamilie von Chorismat-bindenden Enzymen, der MST-Superfamilie, untersucht. Chorismat ist ein zentraler metabolischer Knotenpunkt und der Ausgangspunkt für die Biosynthese zahlreicher wichtiger Metabolite wie der aromatischen Aminosäuren, Folsäure, oder eisenchelatierender Siderophore. Die initialen Reaktionen dieser Biosynthesewege werden ausgehend von Chorismat von Enzymen der MST-Superfamilie katalysiert, die hohe Ähnlichkeiten in Sequenz, Struktur und Reaktionsmechanismus aufweisen. Dennoch nutzen diejenigen MST-Enzyme, die Teil von primärmetabolischen Stoffwechselwegen sind, ausschließlich Ammoniak als Nukleophil für die Bildung von aminosubstituierten Chorismatderivativen, wogegen die MST-Enzyme, die Teil von sekundärmetabolischen Wegen sind, ausschließlich Wasser als Nukleophil für die Bildung von hydroxysubstituierten Chorismatderivativen nutzen. Gemäß der Vorstellung, dass sich sekundärmetabolische Enzyme aus den evolutionär älteren primärmetabolischen Enzymen entwickelt haben, wurde in diesem Teil der Arbeit zunächst untersucht, inwiefern der Übergang von primär- zu sekundärmetabolischen MST-Enzymen mit dem Übergang von Ammoniak auf Wasser als Nukleophil zusammenhängt. Dazu wurden zunächst mit netzwerkbasierten, phylogenetischen und strukturbasierten in silicoMethoden zwei entscheidende Aminosäuren in einem Zugangskanal des aktiven Zentrums identifiziert, die sich signifikant zwischen den primärmetabolischen, Ammoniak-umsetztenden und den sekundärmetabolischen, Wasser-umsetztenden MST-Enzymen unterscheiden. Der Beitrag dieser beiden Aminosäuren zur Substratbzw. Nukleophilspezifität wurde mittels rationalem Design von sechzehn Varianten des primärmetabolischen MST-Enzyms Anthranilatsynthase überprüft. HPLC-MS Experimente zeigten, dass verschiedene Kombinationen von zueinander passenden Aminosäuren an den beiden identifizierten Positionen zu einer Verbreiterung der Nukleophilspezifität von Ammoniak auf Wasser führen. Die aktiven Varianten waren in der Lage, Chorismat unter Verwendung von Wasser als Nukleophil zu Isochorismat umzuwandeln; deren Effizienz war dabei mit der von nativen Isochorismatsynthasen vergleichbar. Diese Varianten konnten ebenso Ammoniak als Nukleophil für die Bildung von Anthranilat zu nutzen, waren also bifunktional. Zusammenfassend wurde durch diese Experimente gezeigt, dass die Nukleophilspezifität von MST-Enzymen ohne große Hürden von Ammoniak auf Wasser ausgedehnt werden kann. Die beobachtete Bifunktionalität der Anthranilatsynthasevarianten lässt vermuten, dass die Evolution der sekundärmetabolischen MST-Enzyme über vergleichbare, bifunktionale Enzymintermediate verlaufen ist. Solche, oft als metabolische Generalisten bezeichnete, Enzyme könnten die Bildung von neuartigen Sekundärmetaboliten (Isochorismat) unter gleichzeitiger Aufrechterhaltung der Biosynthese wichtiger primärer Metaboliten (Anthranilat) erlaubt haben. Ein solches evolutionäres Szenario setzt nicht zwingenderweise eine initiale Genduplikation voraus und vermeidet folglich negative metabolische Effekte, die beispielsweise aus der Beibehaltung von duplizierten, redundanten Genkopien resultieren.
Der dritte Teil dieser Arbeit befasst sich mit der Problematik, wie spezifische ProteinProtein Interaktionen in Superfamilien von strukturell ähnlichen Proteinkomplexen sichergestellt werden und wie die für Interaktionsspezifität entscheidenden Faktoren evolviert sind. Praktisch alle zellulären Prozesse sind essentiell abhängig von spezifischen Interaktionen zwischen Proteinen. Die nötige Spezifität wird generell durch das Zusammenspiel von räumlich und elektrostatisch komplementären Proteinoberflächen, den so genannten interfaces, erreicht. Allerdings ist die Zahl der in der Natur vorkommenden Proteinstrukturen und folglich auch die Zahl der Protein interfacesbegrenzt; dieser Umstand ist bedingt durch den Zwang bei der Proteinfaltung die 2D-Strukturelemente räumlich möglichst effizient zu packen. Zentrale Fragen sind daher, wie trotz der strukturellen Limitationen ausreichende Interaktionsspezifität sichergestellt und wie die Bildug unphysiologischer Komplexe vermieden wird, wenn mehrere Interaktionspartner mit strukturell ähnlichen interfacesvorhanden sind. Um sich diesen Problemen zu nähern, wurden in diesem Teil der Arbeit zunächst die interfaceGeometrien von über 300 bakteriellen, heteromeren Proteinkomplexen im Vergleich zu ihren homologen Verwandten aus den entsprechenden Superfamilien bioinformatisch ausgewertet. Diese Untersuchung zeigte, dass in 10% aller Komplexe, die strukturell ähnliche Untereinheiten besitzen, deutliche Variationen in den interfaceGeometrien auftreten. In diesen Fällen sind die interfacesdurch zusätzliche, definierte Sekundärstrukturelemente, die so genannten interface add-ons, erweitert, die aus ca. 10-20 Aminosäuren bestehen und signifikante Beiträge zur Stabilität der Proteinkomplexe leisten. Aufgrund dieser Eigenschaften lässt sich folgern, dass interface add-onsals eine Art negatives Designelement wirken, dadurch strukturell ähnliche Proteinkomplexe voneinander differenzieren und somit zur Interaktionsspezifität von Proteinkomplexen beitragen. Um diese Vermutung experimentell zu untersuchen, wurde anschließend eine Superfamilie von Glutaminamidotransferasekomplexen, die an der Biosynthese von Tryptophan und Folsäure beteiligt sind, genauer untersucht: Diese heteromeren Komplexe bestehen aus Synthase- und Glutaminaseuntereinheiten, welche miteinander interagieren, um Ammoniak von Glutamin auf ein Akzeptorsubstrat zu übertragen. Ein Teil der Glutaminamidotransferasen dieser Superfamilie – ausschließlich solche, die an der Biosynthese von Tryptophan beteiligt sind – trägt in der Synthaseuntereinheit ein interface add-on. Alle anderen homologen Synthaseuntereinheiten der Superfamilie – auch diejenigen, die an der Biosynthese von Folsäure beteiligt sind – besitzen dieses interface add-onnicht. Die umfassende Charakterisierung von insgesamt 54 Kombinationen verschiedener Synthase- und Glutaminaseuntereinheiten mittels chromatografischer, biophysikalischer, massenspektrometrischer und enzymkinetischer Methoden zeigte eindeutig, dass die An- bzw. Abwesenheit des interface add-onsin der Synthaseuntereinheit die Spezifität für die Interaktionen mit den Glutaminaseuntereinheiten bestimmt. In silicoerstellte Profile von über 15000 archaeellen und bakteriellen Spezies sowie in vivoWachstumsexperimente machten weiterhin deutlich, dass das inter- face add-onder Komplexe aus der Tryptophanbiosynthese biologische Relevanz besitzt: Das interface add-onverhindert Kreuzinteraktionen mit den Untereinheiten des homologen Komplexes aus der Folsäurebiosynthese, welche sich ansonsten negativ auf die zelluläre Fitness auswirken und das Zellwachstum behindern. Abschließend wurde anhand von rational designten Glutaminaseuntereinheiten aufgezeigt, dass in der Evolution des interface add-onsdieser Superfamilie vermutlich intermediäre Komplexe mit breiterer Interaktionsspezifität aufgetreten sind. Bei interface add-onshandelt es sich folglich um evolutionäre Instrumente, die es ermöglichen, spezifische Protein-Protein Interaktionen zu etablieren, wenn aufgrund von ähnlichen interfaceGeometrien zwischen mehreren potentiellen Interaktionspartnern unterschieden werden muss.
Zusammenfassend vertieft die vorliegende Arbeit das Verständnis der Mechanismen, die der Evolution von enzymatischer Mono- und Bifunktionalität zu Grunde liegen, unterstreicht die Bedeutung von multifunktionellen, generalistischen Enzymen für die Evolution des Sekundärmetabolismus und beschreibt ein bisher nicht erkanntes strukturelles Element zur evolutionären Spezifizierung von Protein-Protein Interaktionen.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 21:22
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