LOV domain signaling: A study of LOV-LOV interactions

URN zum Zitieren dieses Dokuments:: urn:nbn:de:bvb:355-epub-356128
DOI zum Zitieren dieses Dokuments:: 10.5283/epub.35612

Magerl, Kathrin

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Veröffentlichungsdatum dieses Volltextes: 23 Apr 2018 05:06

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Dokumentenart:	Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation)
Open Access Art:	Primärpublikation
Datum:	23 April 2018
Begutachter (Erstgutachter):	Prof. Dr. Bernhard Dick und PD Dr. Tilman Kottke
Tag der Prüfung:	21 April 2017
Institutionen:	Chemie und Pharmazie > Institut für Physikalische und Theoretische Chemie > Chair of Chemistry III - Physical Chemistry (Molecular Spectroscopy and Photochemistry) > Prof. Dr. Bernhard Dick
Stichwörter / Keywords:	LOV domains, Protein signaling, Spectroscopy, Förster Resonance Energy Transfer
Dewey-Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie
Status:	Veröffentlicht
Begutachtet:	Ja, diese Version wurde begutachtet
An der Universität Regensburg entstanden:	Ja
Dokumenten-ID:	35612

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Zusammenfassung (Deutsch)

Zusammenfassung (Deutsch)

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Signalentstehung und –weiterleitung in LOV (light-, oxygen- or voltage-sensitive) Domänen. Durch die Absorption von blauem oder nahem UV-Licht bilden diese Blaulichtphotorezeptoren ein Flavin-Cysteinyl-Addukt, welches den Signalzustand des Proteins darstellt. Durch die Adduktbildung werden dynamische und strukturelle Änderungen in der LOV Domäne initiiert wodurch die physiologische Funktion des Proteins reguliert wird.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde einerseits die Photochemie des Flavinmononukleotid (FMN) Chromophors anhand einer modifizierten LOV1 Domäne aus C. reinhardtii (CrLOV1) und des Fluoreszenzreporters iLOV spektroskopisch untersucht. Im Fall von CrLOV1 wurde der Elektronendonor Tyrosin in unmittelbarer Nachbarschaft zum FMN in das Proteingerüst eingebaut. In dieser Mutante lässt sich anstelle der natürlichen Adduktbildung ein Elektronentransfer vom eingebauten Tyrosin auf das FMN nachweisen, obwohl das reaktive Cystein vorhanden ist. Die Abschaltung des natürlichen Reaktionspfads in CrLOV1 durch eine einzige Punktmutation trägt auch zum weiteren Verständnis des Adduktbildungsmechanismus im Wildtyp-System bei.
In der als Fluoreszenzreporter optimierten, künstlichen LOV Domäne iLOV wurden ebenfalls Elektronentransferreaktionen untersucht. In diesem Fall wurde jedoch Asparaginsäure als Protondonor in das Proteingerüst eingebaut. Als Elektronendonoren agieren die natürlich vorhandenen Aminosäuren Tryptophan und Tyrosin. Der Mechanismus des Elektronentransfers konnte mittels zeitaufgelöster Absorptionsspektroskopie aufgeklärt werden.
Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit befasst sich mit intermolekularen Wechselwirkungen zwischen LOV Domänen. Die Änderungen des oligomeren Zustands von LOV Domänen stehen in Zusammenhang mit ihrer biologischen Funktion. Zum besseren Verständnis dieser wurden die Systeme CrLOV1 und die LOV Domäne aus R. sphaeroides mittels Größenausschlusschromatographie und Förster Resonanzenergietransfer (FRET) hinsichtlich ihres Assoziations- und Dissoziationsverhaltens untersucht. Zu diesem Zwecke wurden die LOV Domänen mit den Fluoreszenzfarbstoffen Cy3 und Cy5 markiert. Im Fall der LOV Domäne aus R. sphaeroides konnten somit die Änderungen des oligomeren Zustands nach Aktivierung mit blauem Licht und im Dunkelzustand detailliert untersucht werden. Im Gegensatz dazu zeigte CrLOV1 keine intermolekularen Wechselwirkungen. Diese Ergebnisse sind wichtig für das weitere Verständnis der Funktion von LOV Domänen.

Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)

This thesis deals with LOV (light-, oxygen- or voltage-sensitive) domain signaling. These blue light photoreceptors form a flavin-cysteinyl-adduct as the signaling state upon absorption of blue or near UV light. Adduct formation induces dynamic and structural changes in the LOV domain which regulate the physiological function of the protein.
In the first part of this thesis the photochemistry of the flavin mononucleotide (FMN) chromophore was spectroscopically investigated by means of a modified LOV1 domain of C. reinhardtii (CrLOV1) and the fluorescence reporter iLOV. In the case of CrLOV1, the electron donor tyrosine was introduced into the LOV core nearby the FMN chromophore. Instead of the naturally occurring adduct formation, an electron transfer reaction from the newly introduced tyrosine to the FMN occurs in this mutant, although the reactive cysteine is still in place. The deactivation of the natural reaction pathway in CrLOV1 via a single point mutation also contributes to the deeper understanding of the mechanism of adduct formation in the wild type.
iLOV, an artificial LOV-based domain optimized to serve as a fluorescence reporter, was used as a template to investigate electron transfer in LOV domains. In this case, an aspartic acid was introduced into the LOV core to act as a proton donor. The naturally available amino acids tryptophan and tyrosine could be identified to serve as electron donors. The mechanism of electron transfer in iLOV was resolved by using time-resolved absorption spectroscopy.
The second part of this thesis deals with intermolecular interactions of LOV domains. Changes of the oligomeric state of LOV domains are thought to be linked to their biological function. In order to gain more information on their biological function, CrLOV1 and the LOV domain of R. sphaeroides were investigated via size exclusion chromatography and Förster resonance energy transfer (FRET) regarding their association and dissociation behavior. For that purpose, the LOV domains were labeled with the fluorescent dyes Cy3 and Cy5. Using the labeled proteins, oligomeric state changes upon blue light activation and in the dark could be investigated in detail in the case of the LOV domain of R. sphaeroides. CrLOV1, on the other hand, did not show any intermolecular interactions. These results have strong impact for the understanding of LOV domain function.

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