| License: Publishing license for publications excluding print on demand (9MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-356779
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.35677
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Date: | 31 May 2017 |
| Referee: | Prof. Dr. Achim Göpferich and Prof. Dr. Torsten Blunk |
| Date of exam: | 15 May 2017 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical Technology (Prof. Göpferich) |
| Keywords: | hydrogels, controlled release, proteins, drug delivery |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 500 Natural sciences & mathematics 600 Technology > 615 Pharmacy |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 35677 |
Abstract (English)
The goal of the thesis was to develop hydrogels as depot formulations for the controlled delivery of protein drugs at the target site. To investigate release profiles, protein compatibility and side reactions a commercial available model protein was used. Due to its well characterized structure and properties, lysozyme is ideally suited as model drug. A further advantage of lysozyme is the ...
Abstract (English)
The goal of the thesis was to develop hydrogels as depot formulations for the controlled delivery of protein drugs at the target site.
To investigate release profiles, protein compatibility and side reactions a commercial available model protein was used. Due to its well characterized structure and properties, lysozyme is ideally suited as model drug. A further advantage of lysozyme is the established and well known activity assay to verify integrity and lytic activity after protein release.
Due to its advantages in handling and application, poly(ethylene) glycol (PEG) was chosen as polymeric backbone of the developed formulations. PEG is an approved polymer for parenteral applications. Hydrogel preparation occurs without organic solvents in water preventing incompatibilities at the application site and with incorporated proteins. End-group functionalization can be performed with simple procedures under moderate conditions. PEGs of different chain length and branching are commercially available enabling the variation of mesh size and further hydrogel properties.
To match the goal of controlled delivery, two different strategies to tailor release kinetics were investigated. Firstly, release kinetics was regulated by reversible covalent attachment of the protein to the hydrogel backbone via hydrolytically cleavable linkers. Secondly, release was controlled by the interplay of protein size and hydrogel mesh size. For both cases, a special focus was set on protein integrity and activity after release.
To realize controlled release via cleavable linkers, the protein was tethered to the hydrogel backbone via carbamate linkers with different cleaving kinetics. For this purpose, lysozyme was first PEGylated with the linker. Statistically one arm of the four-armed PEG was modified with the linker group, while the remaining arms were functionalized with an alkyne group. Via copper-catalyzed click reactions of the alkyne group with azide functionalized four-armed PEG the protein was reversibly incorporated into the hydrogel during cross-linking.
In Chapter 2, the synthesis of the gel precursors and the used linkers is described in detail. Furthermore, Chapter 2 reports on the influence of the protein and linker incorporation on the gel characteristics (gel stiffness, swelling and gelation time). In addition, the suitability of these click hydrogels as model systems to investigate protein release is discussed.
Carbamate linkers are hydrolytically cleavable making cleavage and subsequent protein release independent of special conditions of the surrounding tissues such as the presence of enzymes for example. Furthermore, cleavage occurs without the formation of toxic leaving groups or remaining ‘tags’ at the released protein indicating good tolerability of these formulations. The kinetics of linker hydrolysis and subsequent protein release can be controlled by the substitution pattern of the aromatic linker group. The influence of three different substitution patterns on cleaving kinetics was investigated in Chapter 3. For this purpose, firstly, PEGylation and De-PEGylation of protein amino groups was analyzed by Sodium dodecyl sulfate (SDS) polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) using linear methoxy-PEG. A special focus was set on protein integrity and activity after PEGylation and PEG chain elimination. To this end, effects on protein secondary structure were determined by CD spectroscopy (circular dichroism spectroscopy) and an activity assay was performed. The influence of the different linkers on subsequent protein release was investigated using the non-degradable click-hydrogels described above.
SDS-PAGE is an excellent method to investigate PEGylation and follow PEG chain elimination. However, the experimental procedure is time consuming and requires toxic acrylamide for gel preparation. Furthermore, sample preparation including freezing in order to stop elimination and thawing before starting the experiments might negatively affect the protein samples. To overcome these drawbacks a non-toxic, automated real-time measurement was realized using a SEC (size exclusion chromatography) method to investigate PEGylation and PEG chain elimination (Chapter 4).
Another possibility to control protein release is by adjusting the hydrogel mesh size and its degradation. After cross-linking the protein is trapped in the hydrogel network due to its large hydrodynamic diameter. During hydrogel swelling and degradation the mesh size increases resulting in increasing protein mobility and subsequent controlled protein release. Using this strategy the incorporated drug should remain unaffected during cross-linking increasing the chance of protein integrity during formulation and subsequent release. Different delivery systems based on this mechanism have already been developed. Michael addition, Diels-Alder reactions or radical polymerization are common cross-linking reactions to prepare those hydrogels. A critical factor for successful application of such delivery systems is once more the compatibility with the incorporated protein. For that purpose, side reactions between frequently used cross-linking agents and lysozyme were analyzed using SDS-PAGE (Chapter 5).
A specially promising strategy is cross-linking via Dials-Alder reactions. Hydrogel preparation occurs without catalyst or initiator making the reaction excellently suitable for in-situ gelation at the target site. Furthermore, due to the retro-Diels-Alder reaction the hydrogels are biodegradable enabling degradation controlled release. The suitability of Diels-Alder hydrogels for controlled release was investigated in Chapter 6. Two further model proteins, α-CT (α-Chymotrypsin) and γ-globulin were used besides lysozyme to determine protein mobility inside the prepared hydrogels by FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) and to study release profiles. A special focus was again set on possible side reactions and protein activity.
Translation of the abstract (German)
Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung von Hydrogelen als Depotformulierung um eine kontrollierte Protein-Freisetzung direkt am Wirkort zu erzielen. Dabei wurde Lysozym als ein kommerziell erhältliches Modelprotein verwendet um Freisetzungsprofile, Proteinkompatibilität und Nebenreaktionen zu untersuchen. Lysozym ist ein idealer Modelwirkstoff, da seine Struktur und Eigenschaften ausführlich ...
Translation of the abstract (German)
Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung von Hydrogelen als Depotformulierung um eine kontrollierte Protein-Freisetzung direkt am Wirkort zu erzielen.
Dabei wurde Lysozym als ein kommerziell erhältliches Modelprotein verwendet um Freisetzungsprofile, Proteinkompatibilität und Nebenreaktionen zu untersuchen. Lysozym ist ein idealer Modelwirkstoff, da seine Struktur und Eigenschaften ausführlich erforscht sind und ein gut etablierter Aktivitätsassay den Nachweis der strukturellen Unversehrtheit und enzymatischen Aktivität nach der Freisetzung ermöglicht.
Als polymeres Rückgrat der entwickelten Formulierungen wurde Polyethylenglykol (PEG) aufgrund seiner Vorteile hinsichtlich Handhabung und Anwendung gewählt. PEG ist ein für parenterale Applikationen zugelassenes Polymer. Durch die Hydrogelbildung in Wasser frei von organischen Lösungsmitteln können Inkompatibilitäten am Applikationsort und mit dem eingearbeiteten Protein vermieden werden. Die Funktionalisierung der End-Gruppen erfolgt über einfache Synthesewege unter moderaten Bedingungen. Dabei ist PEG mit verschiedenen Kettenlängen und Verzweigungsgraden kommerziell verfügbar, wodurch die Anpassung der Maschenweite und weiterer Gel-Eigenschaften möglich ist.
Um das Ziel der kontrollierten Proteinfreisetzung zu erreichen, wurden zwei verschiedene Strategien zur Anpassung der Freisetzungsgeschwindigkeit untersucht. Zum einen wurde die Freisetzungsgeschwindigkeit über die reversible, kovalente Anbindung des Proteins über hydrolytisch spaltbare Linker realisiert. Zum anderen wurde die Freisetzung über das Zusammenspiel von Proteingröße und Maschenweite des Hydrogel-Netzwerks gesteuert. In beiden Fällen lag ein besonderer Fokus auf der Proteinintegrität und -aktivität nach der Freisetzung.
Zur Steuerung der Freisetzung über spaltbare Linker wurde das Protein über sognannte Carbamat-Linker mit unterschiedlichen Spaltungsgeschwindigkeiten in das Hydrogel-Netzwerk eingebunden. Dazu wurde Lysozym zunächst mit dem jeweiligen Linker PEGyliert. Dabei lag statistisch ein Arm des 4-armigen PEG mit der Linker-Gruppe modifiziert vor, während die übrigen Arme mit einer Alkin-Gruppe funktionalisiert waren. Über eine Kupfer-katalysierte Click-Reaktion der Alkin-Gruppe mit Azid-funktionalisiertem 4-armigen PEG konnte das Protein während der Quervernetzung reversibel in das Gelnetzwerk integriert werden.
In Kapitel 2 ist die Synthese der Gelbildner und Linker im Detail beschrieben. Des Weiteren zeigt Kapitel 2 den Einfluss des eingearbeiteten Proteins und der Linker auf die Geleigenschaften (Gelfestigkeit, Quellung und Quervernetzungszeit). Außerdem wird die Eignung der verwendeten Click-Hydrogele als Modelsystem zur Untersuchung der Proteinfreisetzung diskutiert.
Durch die hydrolytische Spaltung der verwendeten Carbamat-Linker sind die Spaltung und die darauf folgende Proteinfreisetzung unabhängig von speziellen Bedingungen im umliegenden Gewebe, wie beispielsweise der Verfügbarkeit von bestimmten Enzymen. Durch die Abspaltung ohne Bildung toxischer Abgangsgruppen oder verbleibender Gruppen am freigesetzten Protein ist eine gute Verträglichkeit dieser Formulierung zu erwarten. Die Geschwindigkeit der Linker-Hydrolyse und die anschließende Freisetzung können durch das Substitutionsmuster der aromatischen Linker-Gruppe gesteuert werden. Der Einfluss drei verschiedener Substitutionsmuster auf die Spaltungsgeschwindigkeit wird in Kapitel 3 untersucht. Dazu wurde zunächst die PEGylierung und De-PEGylierung der Protein-Aminogruppen unter Verwendung linearen methoxy-PEGs mittels Natriumdodecylsulfat Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) untersucht. Ein besonderer Fokus lag hierbei auf der Proteinintegrität und -aktivität nach der PEGylierung und nach Abspaltung der PEG-Ketten. Dazu wurde die Proteinsekundärstruktur mittels CD-Spektroskopie (Circulardichroismus Spektroskopie) untersucht und ein Aktivitätsassay durchgeführt. Der Einfluss der verschiedenen Linker-Gruppen auf die Freisetzungsgeschwindigkeit des Proteins wurde unter Verwendung der oben beschriebenen nicht-abbaubaren Click-Hydrogele bestimmt.
Obwohl SDS-PAGE eine exzellente Methode zur Untersuchung der PEGylierung und der Abspaltung der PEG-Ketten darstellt, ist die experimentelle Durchführung zeitaufwendig und erfordert die Verwendung toxischen Acrylamids zur Vorbereitung der Gele. Durch das im Rahmen der Probenvorbereitung erforderliche Einfrieren zum Abstoppen der PEG-Ketten Abspaltung und Auftauen unmittelbar vor der Versuchsdurchführung wird die Proteinprobe möglicherweise negativ beeinflusst. Um diese Nachteile zu überwinden wurde eine ungiftige, automatisierte Echtzeit-Messung mittels SEC (Größenausschlusschromatographie) zur Bestimmung der PEGylierung und PEG-Ketten Eliminierung etabliert (Chapter 4).
Eine weitere Möglichkeit die Proteinfreisetzung zu kontrollieren ist die Einstellung der Maschenweite und Abbaugeschwindigkeit des Hydrogels. Dabei ist das Protein durch seinen großen hydrodynamischen Durchmesser nach der Quervernetzung zunächst im Gelnetzwerk eingeschlossen. Durch die Quellung und den Abbau nimmt die Maschenweite des Gels zu, wodurch die Beweglichkeit des Proteins im Gel steigt und die anschließende Freisetzung möglich wird. Verschiedene Freisetzungssysteme, die auf dieser Strategie basieren, wurden bereits entwickelt. Michael-Addition, Diels-Alder Reaktionen oder radikalische Polymerisation sind gängige Quervernetzungsreaktionen zur Bildung dieser Hydrogele. Ein kritischer Faktor für die erfolgreiche Applikation dieser Freisetzungssysteme ist einmal mehr die Kompatibilität mit dem eingearbeiteten Protein. Aus diesem Grund wurden die Nebenreaktionen zwischen häufig verwendeten Quervernetzungsagenzien und Lysozym mittels SDS-PAGE untersucht (Kapitel 5).
Eine besonders vielversprechende Strategie der Quervernetzung ist die Diels-Alder Reaktion. Dabei erfolgt die Hydrogelbildung ohne Verwendung eines Katalysators oder Initiators, wodurch die Reaktion ideal geeignet für eine in-situ Quervernetzung direkt am Wirkort ist. Die Hydrogele sind aufgrund der retro-Diels-Alder-Reaktion bioabbaubar, was eine abbaukontrollierte Freisetzung ermöglicht. Die Eignung der Diels-Alder Hydrogele für die kontorollierte Freisetzung wurde in Kapitel 6 untersucht. Neben Lysozym wurden zwei weitere Modelproteine, α-Chymotrypsin und γ-Globulin, verwendet um die Proteinmobilität in den vorbereiteten Hydrogelen mittels FRAP (Fluorescence Recovery after Photobleaching) sowie die Freisetzungsprofile zu untersuchen. Ein besonderes Augenmerk lag dabei auf möglichen Nebenreaktionen und der Proteinaktivität.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 21:16
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