| License: Publishing license for publications excluding print on demand (16MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-358915
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.35891
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 13 May 2020 |
| Referee: | Prof. Dr. Armin Buschauer |
| Date of exam: | 10 May 2017 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical/Medicinal Chemistry II (Prof. Buschauer) |
| Keywords: | Muscarinic Receptors, Dualsteric Ligands, Radio- and Fluorescently-labeled Ligands |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 35891 |
Abstract (English)
In humans, the family of muscarinic acetylcholine receptors (mAChR, MRs) comprises five subtypes (M1R-M5R), which are members of the class A GPCR superfamily and mediate the action of the neurotransmitter acetylcholine in the central and peripheral nervous system. For instance, the M2R, which binds to Gi/o heterotrimeric G-proteins, acts as a presynaptic autoreceptor in the brain and in the ...
Abstract (English)
In humans, the family of muscarinic acetylcholine receptors (mAChR, MRs) comprises five subtypes (M1R-M5R), which are members of the class A GPCR superfamily and mediate the action of the neurotransmitter acetylcholine in the central and peripheral nervous system. For instance, the M2R, which binds to Gi/o heterotrimeric G-proteins, acts as a presynaptic autoreceptor in the brain and in the periphery. Accordingly, selective M2R antagonism in the CNS results in an enhanced cholinergic transmission, representing a potential therapeutic approach to increase cholinergic function in Alzheimer patients. The development of high affinity and selective MR ligands has been hampered by the high conservation of the orthosteric (acetylcholine) binding site within the five MR subtypes. Therefore, highly selective molecular tools and therapeutic agents, acting at MRs, are lacking. MRs possess various accessory (allosteric) binding sites, which are less conserved. This prompted the design of numerous allosteric MR ligands. However, allosteric modulators with high MR affinity (Ki < 0.1 µM) are not described to date. The dualsteric ligand approach, that means, the design of ligands, which simultaneously bind to the orthosteric pocket and an allosteric site, was suggested as a promising strategy to develop high-affinity and highly selective MR ligands.
In order to investigate the binding mode of dibenzodiazepinone-type MR antagonists at the M2R, three radiolabeled compounds, a monomeric ([3H]19) and two homodimeric ([3H]33, [3H]47) derivatives, were prepared. The results from various detailed experiments performed with [3H]19 and [3H]33, in particular saturation binding studies in the absence and in the presence of reported allosteric M2R ligands, strongly suggested that the studied type of M2R antagonists bind dualsterically to the M2R, interacting simultaneously with both, the orthosteric and the ‘common’ allosteric binding site. The results from molecuclar dynamics (MD) simulations, performed with the M2R (inactive state) bound to 19 or 33, were consistent with the conclusions drawn from radioligand binding studies. Interestingly, the homodimeric ligand 33, in contrast to the monomeric ligand 19, showed a long residence time at the M2R, which might be attributed, as also suggested by MD simulations, to additional contacts of 33 with amino acids constituting the allosteric vestibule.
Moreover, five fluorescently labeled dibenzodiazepinone-type MR ligands (including two homodimeric and one heterodimeric derivative) were prepared using red-emitting cyanine dyes. Equilibrium competition binding studies with the orthosteric antagonist [3H]NMS revealed high M2R affinities for all fluorescent ligands (pKi = 8.85-9.59). Flow cytometric and high-content imaging-based binding experiments with a monomeric (62) and a homodimeric (64) fluorescent ligand in the presence of the reported allosteric modulator W84 (8) suggested that the fluorescent dibenzodiazepinone-type MR ligands bind dualsterically to the M2R, as also concluded for the tritium-labeled analogs [3H]19 and [3H]33. Confocal microscopy with 62 and 64 at CHO-hM2R cells revealed that binding of the fluorescent probes occurred mainly at the cell membrane, and an increase of intracellular fluorescence was not observed with increasing incubation time.
Finally, aiming at MR ligands with improved M2R selectivity, the dibenzodiazepinone pharmacophore was conjugated to several di- and tripeptides via two different linkers yielding a series of non-peptide/peptide hybrid ligands (DIBA-peptide conjugates). The affinity and the selectivity profile of these compounds was assessed by radioligand competition binding at CHO-hMxR cells (x = 1-5) using [3H]NMS. The introduction of two basic amino acids (Arg, Lys) yielded the DIBA-peptide conjugates with the highest M2R selectivity (compound 96 (aliphatic linker, peptide sequence Lys-Arg): Ki M1R:M2R:M3R:M4R:M5R = 58:1:6900:99:300; compound 108 (basic linker, peptide sequence Lys-Ala-Arg): Ki M1R:M2R:M3R:M4R:M5R = 49:1:1800:70:3500). The DIBA-peptide conjugates 96 and 108 represent the most selective M2R antagonists reported to date with M2R binding constants in the low nanomolar (96, pKi = 9.00) and in the picomolar (108, pKi = 10.21) range. Thus, this new class of compounds represents a valuable basis for the development of high affinity and highly selective M2R antagonists.
Taken together, the present work afforded new radio- and fluorescence labeled molecular tools, which bind with high affinity to the M2R. Moreover, the conjugation of the dibenzodiazepinone pharmacophore to short peptides yielded high affinity M2R ligands with improved M2R selectivity compared to previously reported M2 subtype preferring MR ligands.
Translation of the abstract (German)
Die Familie der muskarinergen Acetylcholinrezeptoren (mAChR, MRs) umfasst im Menschen fünf Subtypen (M1-M5R), die zur übergeordneten Klasse A der G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCR) zählen und sind für die Regulation des Neurotransmitters Acetylcholin im zentralen und peripheren Nervensystems verantwortlich. Der M2R beispielsweise, der an heterotrimerische Gi/o G-Proteine bindet, fungiert als ...
Translation of the abstract (German)
Die Familie der muskarinergen Acetylcholinrezeptoren (mAChR, MRs) umfasst im Menschen fünf Subtypen (M1-M5R), die zur übergeordneten Klasse A der G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCR) zählen und sind für die Regulation des Neurotransmitters Acetylcholin im zentralen und peripheren Nervensystems verantwortlich. Der M2R beispielsweise, der an heterotrimerische Gi/o G-Proteine bindet, fungiert als präsynaptischer Autorezeptor im Gehirn sowie in der Peripherie. Selektive M2R Antagonisten des ZNS erzielen dementsprechend eine gesteigerte cholinerge Transmission. Dies stellt einen möglichen therapeutischen Ansatz dar, die cholinerge Funktion bei Alzheimer Patienten zu erhöhen.
Die Entwicklung hochaffiner und hoch-selektiver MR-Liganden ist äußerst schwierig aufgrund der hohen Konservierung der orthosterischen (Acetlycholin-) Bindungstasche der fünf Subtypen. Aufgrund dessen stehen wenige hoch-selektive molekulare Werkzeuge sowie Therapeutika, die an MRs binden, zur Verfügung. Die MRs weisen jedoch einige zusätzliche (allosterische) Bindungsregionen auf, welche weniger konserviert sind. Dies führte zu der Entwicklung zahlreicher allosterischer MR Liganden, die jedoch bis heute noch keine hohe MR Affinität (Ki < 0.1µM) erzielen konnten. Die Entwicklung dualsterischer Liganden, welche sowohl an der orthosterischen als auch an der allosterischen Bindungsstelle binden, wird deswegen als eine aussichtsreiche Strategie zur Entwicklung hochaffiner und hoch-selektiver MR Liganden angesehen.
Um den Bindungsmodus der MR Antagonisten des Dibenzodiazepinon-Typs am M2R zu untersuchen, wurden drei radioaktiv markierte Verbindungen hergestellt: ein monomer ([3H]19) und zwei homodimere Derivate ([3H]33), ([3H]47). Die Ergebnisse der unterschiedlichen Experimente, insbesondere die Sättigungs-Bindungsstudien, die mit ([3H]19) und ([3H]33) in Abwesenheit und in Anwesenheit der bekannten M2R Liganden durchgeführt wurden, weisen stark darauf hin, dass die untersuchten M2R Antagonisten dualsterisch an den M2R binden, wobei sie gleichzeitig sowohl mit der orthosterischen als auch mit der „normalen“ allosterischen Bindungsstelle interagieren. Molecular dynamics (MD) Simulationen, die mit dem M2R (im inaktiven Zustand) gebunden an 19 und 33 durchgeführt wurden, sind vereinbar mit den Schlussfolgerungen der Radioligand-Bindungsstudien. Interessanterweise zeigte der homodimere Ligand 33 im Gegensatz zum monodimeren Liganden 19 eine längere Verweildauer am M2R, was auf den zusätzlichen Kontakt zwischen 33 und Aminosäuren der allosterischen Bindungsregion zurückzuführen ist, was ebenso aus den MD Simulationen vermutet werden konnte.
Des Weiteren wurden fünf fluoreszenzmarkierte MR Liganden des Dibenzodiazepinon-Typs (zwei homodimere und eine heterodimere Verbindung) hergestellt, wobei Rotlicht emittierende Cyaninfarbstoffe verwendet wurden. Kompetitive Gleichgewichts-Bindungsstudien durchgeführt mit dem orthosterischen Antagonisten [3H]NMS zeigten eine hohe M2R Affinität für alle Fluoreszenzliganden (pKi = 8.85-9.59). Fluoreszenz-Durchflusszytometrie und hochauflösende bildgestützte Bindungsexperimente mit dem monomeren (62) und homodimeren (64) Fluoreszenzliganden in Anwesenheit des allosterischen Modulators W84 (8) deuteten darauf hin, dass die fluoreszenzmarkierten MR Liganden des Dibenzodiazepinon-Typs, wie auch das Tritium-markierte Analogon [3H]19 und [3H]33, einen dualsterischen Bindungsmodus an M2R aufweisen. Durch die konfokale Mikroskopie mit 62 und 64 an CHO-hM2R Zellen wurde gezeigt, dass die Bindung der Fluoreszenzliganden hauptsächlich an der Zellmembran stattfindet, wobei keine Erhöhung der intrazellulären Fluoreszenz mit steigender Inkubationszeit beobachtet werden konnte.
Mit der Absicht MR Liganden mit verbesserter Selektivität für M2R zu erhalten, wurde abschließend der Dibenzodiazepinon-Pharmakophor mit einigen Di- und Tripeptiden über zwei unterschiedliche Linker verbunden, wodurch nicht-peptidische/peptidische Hybridliganden (DIBA-Peptid Konjugate) generiert wurden. Die Affinität und Selektivität dieser Verbindungen wurde mit Radioligand-Konkurrenzbindungsversuchen an CHO-hMxR Zellen (x=1-5) mittels [3H]NMS beurteilt. Die Einführung von zwei basischen Aminosäuren (Arg, Lys) erbrachte die DIBA-Peptid Konjugate mit der höchsten M2R Selektivität (Verbindung 96 (aliphatischer Linker, Lys-Arg Peptidsequenz): Ki M1R:M2R:M3R:M4R:M5R = 58:1:6900:99:300, Verbindung 108 (basischer Linker, Lys-Ala-Arg Peptidsequenz):
Ki M1R:M2R:M3R:M4R:M5R = 49:1:1800:70:3500). Die DIBA-Peptid Konjugate 96 und 108 sind die selektivsten M2R Antagonisten, die bisher bekannt sind, mit einer Bindungskonstante im unterem nanomolaren (96, pKi = 9.00) und picomolaren Bereich (108, pKi = 10.21). Damit stellt diese neue Klasse an Verbindungen eine nützliche Grundlage zur Entwicklung hochaffiner und hoch-selektiver M2R Antagonisten dar.
Zusammenfassend stellt diese Arbeit neue radio- und fluoreszenzmarkierte molekulare Werkzeuge zur Verfügung, welche mit hoher Affinität an M2R binden. Des Weiteren konnten durch die Verknüpfung des Dibenzodiazepinon-Pharmakophors mit kurzen Peptiden hochaffine M2R Liganden mit verbesserter M2R Selektivität im Vergleich zu den bisher berichteten M2 präferierenden MR Liganden gewonnen werden.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 21:06
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