| License: Creative Commons Attribution 4.0 (87MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-360368
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.36036
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Date: | 26 July 2017 |
| Referee: | Prof. Dr. Reinhard Sterner and Prof. Dr. Werner Kremer and Prof. Dr. Christine Ziegler |
| Date of exam: | 22 June 2017 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Reinhard Sterner |
| Keywords: | ether lipids, Archaea, geranylgeranylglyceryl phosphate synthase, oligomerization |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 500 Natural sciences & mathematics 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 36036 |
Abstract (English)
In Archaea, ether lipids play an essential role as the main building blocks of the cellular membrane. Recently, ether lipids have also been discovered in the domain of Bacteria, and the key enzymes that catalyze their synthesis, glycerol 1-phosphate dehydrogenase (AraM) and heptaprenylglyceryl phosphate synthase (HepGPS), have been described. In Bacillales, heptaprenylglyceryl phosphate (HepGP) ...
Abstract (English)
In Archaea, ether lipids play an essential role as the main building blocks of the cellular membrane. Recently, ether lipids have also been discovered in the domain of Bacteria, and the key enzymes that catalyze their synthesis, glycerol 1-phosphate dehydrogenase (AraM) and heptaprenylglyceryl phosphate synthase (HepGPS), have been described. In Bacillales, heptaprenylglyceryl phosphate (HepGP) does not become linked to a second polyprenyl moiety like for ether lipids in Archaea, but is dephosphorylated and acetylated. The enzymes that catalyze these reactions have been identified and characterized whithin this work. The phosphatase PhoB acting on HepGP was enriched from a Bacillus subtilis (B. subtilis) cell extract and identified by mass spectrometry. The B. subtilis gene phoB was amplified and heterologously expressed. The dephosphorylation activity of PhoB could be verified in vitro. Nevertheless, the results indicate that any other phosphatase might catalyze dephosphorylation of HepGP as well, because those enzymes only exhibit a low subtrate specificity. By screening a B. subtilis knockout library for deficiency in acetylation, the yvoF gene product was identified to be the acetyltransferase. The yvoF gene was heterologously expressed and YvoF was characterized biochemically. Its acetyl-CoA dependent activity was verified in vitro and catalytic parameters were obtained by a 5,5´-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)-coupled activity assay and a discontinuous radiometric assay. A membrane assoziation of YvoF was inferred from ultracentrifugation experiments. The in vitro acetyltransferase activity was also verified for another YvoF representative, namely from Bacillus anthracis. Because YvoF is a close relative to maltose O-acetyltransferase (MAT), the activity of YvoF was compared to MAT. YvoF and MAT partially overlap in substrate and product range in vitro, but MAT is not able to complement the yvoF knockout in vivo. It remains to be clarified how this in vivo specialization is achieved, and one answer might be that the cellular localization of the two enzymes is different, as the YvoF substrate HepG is associated to the cellular membrane. The biological function of acetylated ether lipids in B. subtilis is still unknown. However, the identification of two enzymes involved in their biosynthesis pathway brings us closer to answer this intriguing question.
The HepGPS belongs to the family of geranylgeranylglyceryl phosphate synthases (GGGPS) and previous studies showed that the members of this family can be dimers or hexamers. Hexameric GGGPS complexes are built from three dimeric modules in the configuration of the native dimers. Besides the dimeric interface (symmetric interface 1), two additional interfaces exist in the hexamer, the symmetric interface 2 and the asymmetric interface 3a/3b. To elucidate the impact of hexamerization on stability and activity, the GGGPS from Methanothermobacter thermautotrophicus (mtGGGPS) was investigated by mutational studies. The symmetric interface 2 and the asymmetric interface 3a/3b were shown to contribute equally to the stabilization of the hexameric structure, because both led to dimerization if disturbed. A mutation that disrupts the dimeric interface led to a further collapse of the dimers into monomers. The thermal stability of the resulting monomeric, dimeric and hexameric mtGGGPS mutants was determined via various biophysical techniques (circular dichroism-, differential scanning calorimetry-, nano differential scanning fluorimetry-measurements and irreversible heat inactivation). In almost all cases, a higher oligomerization state ensured an elevated thermostability and contributed to maintaining activity at higher temperatures. Based on these results, a putative unfolding pathway for mtGGGPS was proposed. First, a transition of the native structure to a stable partially folded intermediate occurs, which is inactive but maintains almost 80-90 % of the overall secondary structure. Depending on the oligomerization state, this 1st transition happens at a temperature between 50 °C (monomeric mutants), 60 °C (dimeric mutants) and 100 °C (hexameric wild type and mutants). Only at elevated temperatures of around 120 °C a second transition presumably leads to a complete denaturation of the protein, irrespective of the oligomerization state. Data obtained with two other couples of hexameric GGGPS wild type and dimeric mutant as well as the analysis of native hexameric and dimeric GGGPS enzymes from different species confirmed the results obtained with mtGGGPS. A steady-state kinetic experiment revealed that the dimeric mutants showed decreased catalytic efficiencies especially due to an increase of the KM for G1P. In summary, it could be shown for almost all hexameric enzymes that when compared to dimeric or monomeric enzymes, hexamerization ensured structural integrity as a prerequisite for thermal stability and activity.
Translation of the abstract (German)
Etherlipide spielen in Archaeen eine essentielle Rolle als Hauptbausteine der Zellmembran. Kürzlich wurden auch in Bakterien Etherlipide entdeckt und die Schlüsselenzyme, die deren Synthese katalysieren identifiziert: die Glycerin-1-phosphatdehydrogenase (AraM) und die Heptaprenylglycerinphosphatsynthase (HepGPS). In Bacillales wird das entstandene Heptaprenylglycerinphosphat (HepGP) jedoch nicht ...
Translation of the abstract (German)
Etherlipide spielen in Archaeen eine essentielle Rolle als Hauptbausteine der Zellmembran. Kürzlich wurden auch in Bakterien Etherlipide entdeckt und die Schlüsselenzyme, die deren Synthese katalysieren identifiziert: die Glycerin-1-phosphatdehydrogenase (AraM) und die Heptaprenylglycerinphosphatsynthase (HepGPS). In Bacillales wird das entstandene Heptaprenylglycerinphosphat (HepGP) jedoch nicht mit einer weiteren Polprenylkette verknüpft, wie es in Archaeen geschieht, sondern nachfolgend dephosphoryliert und acetyliert. Die Enzyme, die für diese Reaktionen verantwortlich sind, wurden im Rahmen dieser Arbeit identifiziert und charakterisiert. Die Phosphatase PhoB, die HepGP dephosphoryliert wurde aus einem B. subtilis Rohextrakt angereichert und mittels Massenspektrometrie identifiziert. Das Gen phoB von B. subtilis wurde amplifiziert und heterolog exprimiert. Die Dephosphorylierungsaktivität von PhoB konnte in vitro nachgewiesen werden. Nichtsdestotrotz kann angenommen werden, dass jede andere Phosphatase auf Grund geringer Substratspezifität diese Dephosphorylierung katalysieren kann. Bei dem Screening einer B. subtilis knockout-Bibliothek auf den Verlust der Acetylierung von HepG wurde das Gen yvoF identifiziert, welches für die Acetyltransferase YvoF kodiert. Das Gen wurde heterolog exprimierte und YvoF biophysikalisch charakterisiert. Die acetyl-CoA-abhängige Aktivität wurde in vitro bestätigt und katalytische Parameter wurden mittels eines 5,5´-Dithiobis-2-nitrobenzoesäure-gekoppelten Assays und eines diskontinuierlichen radioaktiven Assays ermittelt. Auf eine Membranassoziation von YvoF wurde auf Grund von Ultrazentrifugationsergebnissen geschlossen. Die in vitro-Acetyltransferaseaktivität konnte zusätzlich für einen weiteren YvoF-Vertreter aus Bacillus anthracis bestätigt werden. Da YvoF nahe mit der Maltose-O-Acetyltransferase (MAT) verwandt ist, wurden die Aktivitäten von YvoF und MAT untereinander verglichen. YvoF und MAT überlappen teilweise in ihrem Substrat- und Produktspektrum in vitro, aber MAT kann den knockout von YvoF in vivo nicht komplementieren. In der Zukunft muss diese in vivo Spezialisierung noch aufgeklärt werden, eine mögliche Antwort könnte jedoch sein, dass die zelluläre Lokalisierung beider Enzyme unterschiedlich ist, da das Substrat HepG von YvoF membrangebunden vorliegt. Die biologische Funktion von acetylierten Etherlipiden in B subtilis ist bislang unbekannt. Die Identifizierung zweier Enzymen, die an deren Biosyntheseweg beteiligt sind, bringt uns jedoch näher daran diese Frage zu beantworten.
Die HepGPS gehört zu der Familie der Geranylgeranylglycerinphophatsynthasen (GGGPS) und vorangegangene Studien zeigten, dass Mitglieder dieser Familie als Hexamere oder Dimere vorkommen. Hexamere GGGPS sind aus drei dimeren Modulen aufgebaut, welche die Konfiguration der nativen Dimere aufweisen. Neben der Dimerkontaktfläche (symmetrische Kontaktfläche 1) existieren zwei weitere Kontaktflächen im Hexamer, die symmetrische Kontaktfläche 2 und die asymmetrische Kontaktfläche 3a/3b. Um die Auswirkung der Hexamerisierung auf Stabilität und Aktivität zu untersuchen, wurde die GGGPS aus Methanothermobacter thermautotrophicus in Mutagenesestudien untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass die asymmetrische Kontaktfläche 3a/3b und die symmetrische Kontaktfläche 2 gleichermaßen wichtig sind für die Stabilisierung des Hexamers, da beide nach Deletion zu einer Dimerisierung führten. Eine Mutation, die die Dimerkontaktfläche zerstört, führte zu einer Monomerisierung der Dimere. Die thermische Stabilität der hieraus resultierenden Monomere, Dimere und Hexamere wurde mit verschiedenen biophysikalischen Methoden untersucht (Circulardichroismus, Differentielle Scanning-Kalorimetrie, Nano-differentielle Scanning-Fluorimetrie und irreversibler Hitzeinaktivierung). Eine höhere Oligomerisierung sicherte in fast allen untersuchten Fällen eine höhere Thermostabilität und trug zum Erhalt der Aktivität bei hohen Temperaturen bei. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde ein möglicher Auffaltungsweg für mtGGGPS postuliert. Zuerst geschieht ein Übergang der nativen Struktur zu einem stabilen teilweise gefalteten Intermediat, welches inaktiv ist, jedoch noch ca. 80-90 % der gesamten Sekundärstruktur des nativen Zustands aufweist. Je nach Oligomerisierungszustand geschieht dieser erste Übergang bei Temperaturen von 50 °C (monomere Mutanten), 60 °C (dimere Mutanten) und 100 °C (hexamerer Wildtyp und Mutanten). Erst bei höheren Temperaturen um 120 °C führt ein zweiter Übergang unabhängig vom Oligomerisierungszustand vermutlich zu einer kompletten Entfaltung des Proteins. Daten von zwei weiteren hexameren wildtypischen GGGPS und dimeren Mutanten sowie die Analyse von nativen hexameren und dimeren GGGPS verschiedener Spezies bestätigten die Ergebnisse, die mit mtGGGPS erhalten wurden. Steady-state-Kinetiken zeigten, dass die dimere Mutanten eine drastische Verschlechterung in der katalytischen Effizienz aufwiesen, hauptsächlich aufgrund einer verminderten Affinität für G1P. Zusammenfassend konnte für fast alle hexameren Enzyme im Vergleich zu dimeren und monomeren Enzymen gezeigt werden, dass Hexamerisierung eine strukturelle Integrität als Voraussetzung für thermische Stabilität und Aktivität gewährleistet.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 21:04
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