Ziel dieser Arbeit war es instabile Treg nach Verlust von FOXP3 immunphänotypisch, funktionell und molekularbiologisch zu charakterisieren und damit deren potentielles Risiko als Kontamination von Treg Produkten für den adoptiven Transfer abzuschätzen. Die Wichtigkeit der Ergebnisse ergibt sich durch den zunehmenden Einsatz von Treg Produkten in klinischen Studien zur Prophylaxe bzw. Therapie der Graft-versus-Host Erkrankung nach allogener Stammzelltransplantation sowie im Rahmen der Behandlung von Autoimmunerkrankungen. Dies sollte einerseits durch die Erweiterung der für die FACS-Färbung zur Verfügung stehenden Antikörper um die Transkriptionsfaktorantikörper gegen T bet, GATA3 und RORγ(t) ermöglicht werden. Andererseits sollte die Entwicklung neuer Färbeprotokolle die Isolation intakter RNA für anschließende Transkriptomanalysen aus in vitro expandierten und spezifisch für FOXP3 FACS-separierten humanen regulatorischen T Zellen möglich machen.
Es wurde gezeigt, dass die sogenannten liniendefinierenden Transkriptionsfaktoren T-bet, GATA3 und RORγ(t) nicht ausschließlich in Zellen der jeweiligen T-Helferzelllinien exprimiert werden. Dies erweitert unser Verständnis von T-Helferzelldifferenzierung und Plastizität dahingehend, dass zur Identifikation spezifischer T-Zellfunktionen nicht die Analyse eines einzelnen Transkriptionsfaktors ausreicht, sondern vielmehr die Kenntnis eines möglichst detaillierten Transkriptionsfaktor- und Zytokinprofils notwendig ist. Als Ausnahme ist hier FOXP3 zu nennen, dessen stabile Expression für sich alleine als definierender Marker für regulatorische T-Zellen ausreichend zu sein scheint.
Mit der Etablierung des Protokolls für eine intrazelluläre Färbung mittels Ethanol/Tryptonpuffer steht eine neue Methode zur Verfügung, FACS-Analysen von intra- und extrazellulären Molekülen durchzuführen und anschließend eine Isolation intakter mRNA durchzuführen. Nach einer individuellen Austestung der neuen Färbemethode für andere Transkriptionsfaktoren ist es zudem in Zukunft möglich Transkriptomanalysen an Zellpopulationen durchzuführen, die sich überwiegend oder sogar ausschließlich durch die Expression spezieller intrazellulärer Marker definieren. In dieser Arbeit werden erstmals Transkriptomanalysen an FOXP3-sortierten menschlichen Treg durchgeführt.
Mit Hilfe der neuen Methode gelang es nachzuweisen, dass in vitro expandierte CD4+CD25highCD45RA- Zellen, welche nach Expansion ihr FOXP3 verlieren, vor allem zu Th2 Zellen differenzieren. Dies zeigt sich sowohl auf Protein wie auch auf mRNA Ebene. Die Wichtigkeit dieser Ergebnisse wird dadurch unterstrichen, dass der Anteil zytokinproduzierender Zellen in in vitro expandierten CD4+CD25highCD45RA- FOXP3- Zellen höher ist als der unter den CD4+ konventionellen T-Zellen im peripheren Blut. Für die klinische Anwendung von in vitro expandierten Treg zur Prophylaxe und/oder Therapie der GvHD nach allogener SZT erscheinen deshalb insbesondere expansionsstabile CD45RA+ Treg geeignet.

Human regulatory T cells are used as cellular therapeutics for autoimmune diseases and for the prevention or treatment of alloresponses after organ or stem cell transplantation at a progressive rate. As human Treg with a naive phenotype rapidly downregulate the lineage-describing transcription factor FOXP3 during in vitro expansion, it was necessary to examine these cells on immunophenotypic, functional and molecular basis. Thus, the risk due to possible contamination of Treg cell products with such cells should be evaluated. This scientific issue required the development of a new intranuclear staining protocol that permits the isolation of intact mRNA from fixed, permeabilized and FACS-purified cell populations as well as the introduction of additional antibodies against human transcription factors for flow cytometry.
It was found that the so-called lineage describing transcription factors Tbet, GATA3 and RORγ(t) are not exclusively expressed in the respective T helper cell lineages, indicating that the knowledge of an explicit transcription factor and cytokine profile is needed to characterise T helper cell functions rather than a singular transcription factor.
The development of a new intranuclear staining protocol that permits the isolation of intact mRNA from fixed, permeabilized and FACS-purified cell populations enables the investigation of cell lineages that are exclusively or predominantly characterized by the expression of intracellular markers on molecular basis. Further tests may although adapt the new method to other intracellular antibodies.
With the new method, it was possible to show that in vitro expanded CD4+CD25highCD45RA- cells mainly turn into Th2 cells upon loss of FOXP3. This can be seen on protein level as well as on mRNA level. The importance of these findings was especially emphasized by the fact that the percentage of cytokine producing cells in ex-Treg was higher than in conventional CD4+ T cells from the peripheral blood. This again favors the use of CD45RA+ Treg for in vitro expansion if the cell products want to be used to treat and/or Graft-versus-Host-Disease after allogenic stem cell transplantation.