| Lizenz: Creative Commons Namensnennung 4.0 International PDF - Angenommene Version (12MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-362920
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.36292
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 1 Oktober 2018 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Ralf Wagner |
| Tag der Prüfung: | 23 Oktober 2017 |
| Institutionen: | Medizin > Lehrstuhl für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene |
| Stichwörter / Keywords: | HIV-1 envelope, FACS, high-throughput screening, immunogen design, vaccine development |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 36292 |
Zusammenfassung (Englisch)
HIV`s vast genetic diversity has prevented the success of common vaccine approaches. Currently, HIV-1 vaccine development focuses on the induction of broadly neutralizing antibodies (bnAbs), which target various epitopes on the trimeric envelope (Env) protein. The most potent bnAbs known today are able to neutralize more than 90 % of circulating virus strains; however, their development requires ...
Zusammenfassung (Englisch)
HIV`s vast genetic diversity has prevented the success of common vaccine approaches. Currently, HIV-1 vaccine development focuses on the induction of broadly neutralizing antibodies (bnAbs), which target various epitopes on the trimeric envelope (Env) protein. The most potent bnAbs known today are able to neutralize more than 90 % of circulating virus strains; however, their development requires a complex co-evolution of virus and humoral immune system. Therefore, induction of bnAbs by active immunization remains extremely difficult, demanding both improved Env immunogens as well as innovative screening techniques for their identification.
The first project of this thesis investigated a mammalian cell display and cell sorting-based panning technique for the identification of vaccine candidates with improved antigenicity. This panning procedure combines the advantages of (i) single integration of Env into a distinct FRT site to link genotype and phenotype within a stable cell line library, (ii) inducible Env expression to avoid cytotoxicity effects, (iii) translational coupling of Env and GFP to normalize for induced Env expression and (iv) display on HEK cells to ensure native folding and mammalian glycosylation. Using a model library of five envelope chimeras with distinct binding profiles to mAbs 447-52D and HGN194, cell sorting selectively enriched the high affinity variant up to 55- and 56-fold, respectively, and low affinity variants up to 237-fold after only a single round of panning. Notably, affinity rankings of cell surface displayed and purified secreted trimers were equal, suggesting that binding properties of Env variants selected with this approach can also guide the identification of soluble envelope antigens. Applying more elaborate Env libraries to screen the currently available set of broadly neutralizing monoclonal antibodies and their engineered unmutated common ancestors, this stable cell line-based panning technology therefore provides a valuable tool for the selection of new HIV-1 Env vaccine candidates. Ultimately, this technique may also be applicable to other bnAb-dependent vaccine endeavors targeting e.g. Influenza-, Hepatitis C- or Cytomegalovirus.
A second project focused on the mapping of envelope-bnAb interactions for the rational design of novel Env immunogens. To this end, mammalian cell display of an envelope alanine library based on C clade isolate 96ZM651 was applied in a high-throughput flow cytometry assay to map envelope interactions with different mAbs as well as soluble CD4 (sCD4). Interestingly, this approach was able to directly identify amino acid substitutions which improved Env antigenicity and folding. Combination of these mutations ultimately resulted in both membrane-bound and soluble envelope immunogens with increased affinity to bnAbs PG9 (targeting the trimer apex) and VRC01 (targeting the CD4 binding site), while the binding of non-neutralizing mAb 17b could be profoundly reduced. Notably, these trimers also exhibited enhanced trimerization and potentially improved folding. Optionally, a mutation which drastically reduced recognition of CD4 could be included, which could be beneficial for a neutralizing antibody response in vivo by prohibiting the profound CD4-induced conformational change of Env. Although the improved structural and antigenic phenotypes of those mutants were originally identified for 96ZM651 envelope, these favourable properties were also applicable to variants of other clade A, B and C isolates, including engineered, trimer-stabilized SOSIP constructs. Of note, membrane-bound gp145 and soluble gp140 variants thereby exhibited the same effects, indicating that this flow cytometry-based mapping procedure is able to guide the design of membrane-bound and soluble vaccine candidates from different subtypes. Additionally, affinity-enhanced soluble envelope trimers were stabilized by chemical cross-linking. This further reduced the binding of non-neutralizing antibodies and markedly increased thermostability, which correlates with the elicitation of neutralizing antibodies. The most potent envelope immunogens developed in this thesis will be analyzed in a preclinical immunization study starting in June 2017 to determine whether their improved antigenicity and stability in vitro will ultimately translate into enhanced immunogenicity in vivo.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Aufgrund der enorm hohen genetischen Variabilität von HIV-1 sind konventionelle Impfstoffstrategien bislang gescheitert. Heute fokussiert sich die HIV-1 Vakzineentwicklung vor allem auf die Induktion breitneutralisierender Antikörper (bnAbs), die sich gegen verschiedene Epitope auf dem trimeren Oberflächenprotein Envelope (Env) richten. Die Besten heute bekannten bnAbs können über 90 % der ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Aufgrund der enorm hohen genetischen Variabilität von HIV-1 sind konventionelle Impfstoffstrategien bislang gescheitert. Heute fokussiert sich die HIV-1 Vakzineentwicklung vor allem auf die Induktion breitneutralisierender Antikörper (bnAbs), die sich gegen verschiedene Epitope auf dem trimeren Oberflächenprotein Envelope (Env) richten. Die Besten heute bekannten bnAbs können über 90 % der zirkulierenden Virusstämme neutralisieren. Ihre Entstehung erfordert allerdings eine komplexe Koevolution zwischen Virus und humoralem Immunsystem, sodass ihre Induktion durch aktive Immunisierung immer noch enorm schwierig ist. Aus diesem Grund sind sowohl verbesserte Env Immunogene, als auch Methoden zu deren Identifizierung nötig.
Das erste Projekt dieser Promotion beschäftigte sich mit einer Panning-Technologie, mit der durch Zellsortierung Envelopes mit verbesserten Antigenitätsprofilen aus einer Bibliothek basierend auf stabilen Zelllinien selektiert werden können. Dabei werden folgende Vorteile miteinander kombiniert: (i) Integration nur einer Env Variante in eine definierte FRT-Stelle pro Zelle, um Genotyp und Phänotyp innerhalb der Bibliothek effektiv zu verlinken, (ii) induzierbare Env Expression, um Zytotoxizitätseffekten vorzubeugen, (iii) translationale Verknüpfung von GFP und Env, um auf die induzierte Env Expression normalisieren zu können und (iv) Expression der Env Varianten auf HEK-Zellen, um native Faltung und Säugetierglykosylierung zu gewährleisten. Unter Verwendung einer Modelbibliothek aus fünf Env-Chimären mit definierten Bindungsprofile zu den monoklonalen Antikörpern 447-52D und HGN194 konnte die Variante mit der höchsten Affinität zu beiden Antikörpern in nur einem Panningzyklus jeweils bis zu 55- bzw. 56-fach angereichert werden. Gleichzeitig zeigten die jeweiligen niedrig affinen Varianten Anreicherungsfaktoren von bis zu 237-fach. Interessanterweise zeigten membranständige und gereinigte lösliche Env Trimere die gleiche Rangfolge bezüglich ihrer Affinitäten. Somit kann diese Technologie auch für die Identifizierung löslicher Antigene wegweisend sein. Mit Hilfe komplexerer Envelope-Bibliotheken und dem derzeit vorhandenen Set an bnAbs und deren berechneter Keimbahnvarianten stellt diese Methode somit ein wertvolles Instrument zur Identifizierung neuer HIV Vakzinekandidaten dar. Dabei ist dieses Verfahren nicht nur auf HIV beschränkt, sondern kann auch auf andere bnAb-abhängige Impfstoffvorhaben ausgeweitet werden, wie z.B. Influenza, Hepatitis C oder Cytomegalievirus.
Das zweite Projekt dieser Promotion beruhte auf der Kartierung von Envelope-bnAb-Interaktionen für das rationale Design neuer Env Immunogene. Dazu wurde eine membranständige Envelope Alanin-Bibliothek des Subtyp C Isolats 96ZM651 in einem Durchflusszytometrie-basierten Hochdurchsatzverfahren verwendet. Die Expression der Varianten fand dabei ebenfalls auf HEK-Zellen statt, um native Faltung und Säugetierglykosylierung zu gewährleisten. Mit Hilfe dieser Technologie wurden die Interaktionsflächen von Env sowohl zu den breitneutralisierenden Antikörpern PG9, welcher den Apex des Trimers angreift, und VRC01, der die CD4 Bindestelle erkennt, als auch zu löslichem CD4 (sCD4) untersucht. Interessanterweise wurden dabei Mutationen identifiziert, welche sowohl die Antigenität, als auch die Trimerisierung und Faltung von Env positiv beeinflussen. Die Kombination dieser Mutationen resultierte schließlich in erhöhter Affinität zu PG9 und VRC01, verringerter Bindung des nicht neutralisierenden Antikörpers 17b und verbesserter Trimerbildung. Optional konnte durch Einfügen einer weiteren Mutation außerdem die Bindung an sCD4 verhindert werden. Da diese eine tiefgreifende Konformationsänderung in Env auslöst, welche eine Vielzahl nicht neutralisierender Antikörperepitope freilegt, würde dies in vivo wahrscheinlich eine neutralisierende Antikörperantwort unterstützen. Die ursprünglich für 96ZM651 Envelope identifizierten Mutationen und deren Kombinationen konnten erfolgreich auf andere Isolate der Subtypen A, B und C, sowie auf trimerstabilisierte SOSIP-Varianten übertragen werden. Außerdem zeigten membranständige und lösliche Envelope Trimere die gleichen Effekte, was den Wert dieses Verfahrens für die Entwicklung löslicher Vakzinekandidaten unterschiedlicher Subtypen verdeutlicht.
Außerdem konnten die generierten Mutanten durch chemisches Cross-Linking weiter stabilisiert werden. Dies reduzierte zusätzlich die Bindung nicht-neutralisierender Antikörper, während die Thermostabilität der Trimere, und somit deren Fähigkeit neutralisierende Antikörperantworten zu induzieren, deutlich erhöht wurde. Eine präklinische Immunisierungsstudie wird ab Juni 2017 prüfen, ob die in vitro demonstrierte verbesserte Antigenität und Stabilität der generierten Immunogene letztendlich auch deren Immunogenität positiv beeinflusst.
Metadaten zuletzt geändert: 25 Nov 2020 20:49
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