| Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Publikationen ohne Print on Demand (51MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-363644
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.36364
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 30 November 2018 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Achim Göpferich |
| Tag der Prüfung: | 17 November 2017 |
| Institutionen: | Chemie und Pharmazie > Institut für Pharmazie > Lehrstuhl Pharmazeutische Technologie (Prof. Göpferich) |
| Stichwörter / Keywords: | click chemistry, hydrogel, antibody, controlled release, Diels-Alder reaction, thiol-ene reaction, age-related macular degeneration, microfluidics, polyanion |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 615 Pharmazie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 36364 |
Zusammenfassung (Englisch)
This thesis was focused on the development of click hydrogels for the controlled local delivery of therapeutic antibodies. In 2001, the term “click chemistry” was first introduced by Sharpless and coworkers as an umbrella term for “spring-loaded” reactions that are modular, wide in scope, stereospecific, give high yields, proceed at simple conditions, and do not form toxic by-products. Since ...
Zusammenfassung (Englisch)
This thesis was focused on the development of click hydrogels for the controlled local delivery of therapeutic antibodies.
In 2001, the term “click chemistry” was first introduced by Sharpless and coworkers as an umbrella term for “spring-loaded” reactions that are modular, wide in scope, stereospecific, give high yields, proceed at simple conditions, and do not form toxic by-products. Since that time, click reactions have had tremendous influence in many research areas including pharmaceutics and material science.
Without a doubt, the Diels-Alder (DA) reaction is one of the click reactions with the greatest potential for the development of biomaterials and drug delivery systems. For example, besides the above-mentioned general advantages of click chemistry, the DA reaction does not require a metal catalyst. Therefore, the DA reaction has already been utilized in various biomedical areas, such as the synthesis of polymers and dendrimers, surface functionalization, bioconjugation, nanotechnology, and hydrogel design. For many of these applications the diene-dienophile pair furan and maleimide was utilized as they are readily available and the functionalization is comparably simple. For example, multi-armed poly(ethylene glycol) (PEG) functionalized with maleimide and furan have been utilized to prepare DA-hydrogels. However, the DA reaction is also associated with a number of disadvantages. For example, the reaction is reversible which may be unfavorable for the preparation of stable conjugates. However, the two most serious drawbacks of the reaction are its low reaction rate and potential side-reactions, e.g., the reaction of maleimide with nucleophilic amino acid side-chains (Chapter 1).
The goal of this thesis was to utilize the DA reaction for the development of hydrogels that can be applied in local antibody therapy. In order to exploit its full potential, the two main disadvantages of the DA reaction had to be circumvented while its advantages had to be utilized. To be more specific, DA hydrogels that gel more rapidly and that do not undergo side-reactions with proteins had to be developed. To this end, various approaches including chemical modification, the use of protective additives or combination with other click reactions were employed (Chapter 2).
For DA hydrogels, gelation is achieved through covalent cross-linking. Therefore, it was hypothesized that gel formation can be accelerated by facilitating the interaction between the reactive groups. Amphiphilic macromonomers were prepared by introducing hydrophobic 6-aminohexanoic acid (C6) and 12-aminododecanoic acid (C12) spacers between the polymer backbone and the functional end-groups. The general associative nature of the macromonomers was verified by an increase in viscosity and the formation of associates or micelles. As a consequence of the hydrophobic association, the reactive groups were brought into close proximity and gelation occurred significantly faster, e.g., twice as fast using a C12 spacer. Interestingly, gel times did not decrease when a modified and a non-modified component were combined, e.g., unmodified PEG-maleimide with modified PEG-furan. This finding further emphasizes the importance of hydrophobic association for accelerated gel formation. Moreover, hydrogels with hydrophobic modification were characterized by a lower average network mesh size and a higher elastic modulus which suggested a more efficient cross-linking process. Furthermore, through hydrophobic modification an increase of hydrogel stability could be achieved. This could be explained by the combined effects of higher cross-linking density and the increased hydrolytic resistance of maleimide moieties resulting from N-alkylation. All of these effects were influenced by spacer length: C12-modification exhibited stronger effects on gelation, stability, and stiffness than C6-modification. In addition, it was found that hydrophobic modification can be used as a tool to achieve delayed antibody release. While the in vitro release of bevacizumab from the unmodified DA-hydrogel was completed after only 10 days, hydrophobic modification delayed the release for about 30 days using C6 and almost 60 days using C12 spacers (Chapter 3).
Although gel times could be significantly decreased using hydrophobic modification instantaneous gelation still could not be achieved. In order to develop DA-hydrogels that provide immediate gelation a dual approach was employed. Instead of eight-armed PEGs, thermoresponsive four-armed poloxamines were utilized for macromonomer synthesis and functionalized with maleimide and furyl moieties. Aqueous solutions of these macromonomers exhibited an immediate gelation at body temperature. Concomitantly, the functional end-groups led to covalent cross-linking of the gels. In this way, the rapid sol-gel transition of physical gelation and the stability of chemically cross-linked gels were combined in a hybrid system. In addition, further branches were introduced to create a more versatile hydrogel platform that allowed for tailoring of the core characteristics, i.e., mechanical properties and stability. Hydrogel stability could be precisely controlled in the range of 14 to 329 days depending on the composition used. Finally, controlled release of the model antibody bevacizumab could be achieved over a period of 7, 21, and 115 days in vitro. The release curves were characterized by a notably low burst and a triphasic shape. Most importantly, almost all of the loaded antibody could be recovered after release and approximately 87% displayed functional binding. In conclusion, DA-Poloxamines are rapidly gelling, mechanically stable, degradable, nontoxic, and provide controlled antibody release. As they can be tailored to match the demands of various applications they present a powerful material for controlled local antibody delivery (Chapter 4).
Besides slow gelation, the second major drawback of DA-hydrogels are undesired side-reactions with proteins. As potential approach to solve this issue, antibodies could be incorporated into hydrogel microparticles to safeguard them from detrimental cross-linking reactions. Moreover, such antibody-loaded microgels could find use as a delivery platform for controlled local release. However, the fabrication of antibody-loaded microgels with a narrow size distribution and without impairing protein stability is a challenging task. To achieve this goal, a fabrication method combining microfluidics and thiol-ene photoclick chemistry was employed. Microfluidics is a well-characterized approach for the generation of uniform droplets that does not expose materials to harmful stress conditions. On the other hand, the thiol-ene reaction is known to be compatible with proteins and can be triggered using visible light. To fabricate the microparticles, first aqueous droplets containing antibody, macromonomers and reactants were generated using a microfluidic device. Then, green light was used to covalently cross-link the droplets and encapsulate the antibody. In order to tailor microgel properties a macromonomer library comprising both hydrolytically labile and stable eight-armed PEGs with various molecular masses was synthesized. Then, rheology was used to determine the necessary irradiation time and to study mechanical properties. These microgels had a rod-like shape and a narrow size distribution with an approximate width of 380 μm and lengths of 1400 μm or 2150 μm, depending on the process parameters. Bevacizumab was successfully incorporated into the microgels and a sustained release could be achieved over a period of 28 and 46 days. Moreover, it was confirmed that the process developed does not significantly impair the binding ability of bevacizumab. Therefore, the strategy is suitable for loading antibodies into microgels and presents a promising starting point for further development. In future experiments, the general hypothesis that the incorporation into microgels safeguards proteins needs to be verified. Moreover, for delivery purposes microgels with smaller dimensions should be generated to allow for injection or inhalation. This could be achieved by fine tuning of the flow ratio and by using tubes with smaller diameters (Chapter 5).
Although encapsulation into microgels might be an effective approach to overcome protein-polymer conjugation during cross-linking, it is a comparably complicated approach. It would be ideal if Michael-type reactions of maleimide could be avoided by simply adding a protective additive. For this purpose, a number of pharmaceutically relevant polyanions were evaluated, i.e., alginate, dextran sulfate, heparin, hyaluronic acid, and poly(acrylic acid). Electrostatic interactions led to reversible binding of the polyanions to the protein surface. Thereby, the reaction of maleimide with nucleophilic moieties on the protein surface could be prevented. These results were confirmed using the model protein lysozyme and by simulating the reaction conditions with monofunctional mPEG5k-maleimide and mPEG5k-furan. For example, at pH 7.4 and without polyanions about 61% of lysozyme was PEGylated and the activity had decreased to about 20% of the initial activity. In comparison, when dextran sulfate had been added an activity of 98% remained and no PEGylation was detected. Overall, dextran sulfate, heparin, and poly(acrylic acid) were identified as the most effective additives to shield proteins during cross-linking. In addition, it could be confirmed that the “shielding” is solely based on electrostatic interactions as the effect could be reversed by adding high salt concentrations. Furthermore, it could be demonstrated that the protective effect can be utilized at acidic, neutral, and basic pH which makes it a particularly versatile tool for protein formulation and delivery. Nevertheless, in order to optimally protect proteins from undesired reactions, cross-linking should be carried out at acidic pH and with polyanions present. These conditions are optimal because on the one hand, at acidic pH the reactivity of nucleophilic groups (e.g., amines) is decreased and on the other, proteins carry a higher positive charge than at neutral pH which facilitates electrostatic interactions with polyanions (Chapter 6).
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Diese Dissertation beschäftigte sich mit der Entwicklung von Klick Hydrogelen für die kontrollierte lokale Freisetzung therapeutischer Antikörper. Im Jahr 2001 wurde der Begriff "Klick-Chemie" von Sharpless und seinen Mitarbeitern als Oberbegriff für "federgespannte" Reaktionen eingeführt, die modular, vielseitig einsetzbar und stereospezifisch sind, hohe Ausbeuten liefern und unter sehr ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Diese Dissertation beschäftigte sich mit der Entwicklung von Klick Hydrogelen für die kontrollierte lokale Freisetzung therapeutischer Antikörper.
Im Jahr 2001 wurde der Begriff "Klick-Chemie" von Sharpless und seinen Mitarbeitern als Oberbegriff für "federgespannte" Reaktionen eingeführt, die modular, vielseitig einsetzbar und stereospezifisch sind, hohe Ausbeuten liefern und unter sehr einfachen Bedingungen ohne Bildung von toxischen Nebenprodukten ablaufen. Seit dieser Zeit hatten Klick Reaktionen einen enormen Einfluss auf verschiedene Forschungsgebiete, einschließlich der Pharmazie und den Materialwissenschaften.
Ohne Zweifel ist die Diels-Alder (DA) Reaktion eine der Klick Reaktionen mit dem größten Potential für die Entwicklung von Biomaterialien und Arzneistoffträgersystemen. Dies ist beispielsweise dadurch zu begründen, dass neben den oben genannten Vorteilen für die Durchführung der DA Reaktion kein Metallkatalysator nötig ist. Aus diesem Grund wurde die DA Reaktion bereits in verschiedenen biomedizinischen Bereichen verwendet, wie zur Synthese von Polymeren und Dendrimeren, der Funktionalisierung von Oberflächen, der Biokonjugation, der Nanotechnologie und dem Design von Hydrogelen. Für viele dieser Anwendungen wird das Dien-Dienophil-Paar Furan und Maleinimid verwendet, da die Ausgangsprodukte leicht verfügbar sind und die Funktionalisierung vergleichsweise einfach durchzuführen ist. Beispielsweise, wurde mehrarmiges Polyethylenglykol, das mit Maleinimid und Furan Gruppen funktionalisiert wurde, zur Herstellung von DA-Hydrogelen verwendet. Jedoch ist die DA Reaktion auch mit einigen Nachteilen behaftet. Zum Beispiel ist die Reaktion reversibel, was für die Herstellung stabiler Konjugate sehr nachteilig ist. Zweifelsohne sind die beiden schwerwiegendsten Nachteile der Reaktion jedoch ihre langsame Reaktionsgeschwindigkeit und mögliche Nebenreaktionen, wie die Reaktion von Maleinimid mit nukleophilen Aminosäureseitenketten (Kapitel 1).
Das Ziel dieser Arbeit war die DA Reaktion für die Entwicklung von Hydrogelen, die im Bereich der kontrollierten lokalen Antikörpertherapie verwendet werden können, zu nutzen. Um das volle Potential der Reaktion anwenden zu können, sollten die Vorteile der Reaktion genutzt werden, wobei die beiden Hauptnachteile umgangen werden sollten. Konkret bedeutete das, dass schnell gelierende Hydrogele entwickelt werden sollten, die keine Nebenreaktionen mit Proteinen zeigen. Um dieses Ziel zu erreichen, wurden verschiedene Herangehensweisen gewählt, wie chemische Modifikation, die Verwendung protektiver Additive oder die Kombination mit anderen Klick Reaktionen (Kapitel 2).
Bei den DA-Hydrogelen wird die Gelbildung durch kovalente Quervernetzung erreicht. Daher wurde die Hypothese aufgestellt, dass sich die Gelbildung dadurch beschleunigen lässt, dass man die Interaktion zwischen den reaktiven Endgruppen verbessert. Aus diesem Grund wurden durch das Einbringen von hydrophoben 6-Aminohexansäure (C6) und 12-Aminododekansäure (C12) Ketten zwischen dem Polymerrückgrat und den funktionellen Gruppen amphiphile Makromonomere hergestellt. Die assoziativen Eigenschaften dieser Makromonomere wurden durch einen Anstieg der Viskosität und die Bildung von Assoziaten beziehungsweise Mizellen bestätigt. Durch die hydrophobe Zusammenlagerung, konnten die reaktiven Gruppen in räumliche Nähe gebracht und die Gelierung dadurch signifikant beschleunigt werden, z.B. verdoppelt im Falle der C12 Ketten. Interessanterweise verringerte sich die Gelierungszeit nicht, wenn modifizierte und nicht-modifizierte Komponenten kombiniert wurden, z.B. unmodifiziertes PEG-Maleinimid mit modifiziertem PEG-Furan. Diese Beobachtung unterstrich die Bedeutung der hydrophoben Assoziation für die beschleunigte Gelierung noch weiter. Hydrogele mit hydrophober Modifikation waren außerdem durch eine geringere durchschnittliche Maschenweite und ein höheres E Modul gekennzeichnet, was einen effizienteren Quervernetzungsprozess nahelegt. Weiterhin konnte durch die Modifikation ein deutlicher Anstieg der Stabilität erzielt werden. Dies konnte durch die kombinierten Effekte der höheren Quervernetzungsdichte und den Anstieg der hydrolytischen Resistenz der Maleinimide durch die N-Alkylierung erklärt werden. Alle beschriebenen Effekte hingen von der Länge der hydrophoben Kette ab: C12 Modifikation hatte einen stärkeren Effekt auf Gelierung, Stabilität und mechanische Festigkeit als C6 Modifikation. Weiterhin wurde entdeckt, dass hydrophobe Modifikation als Werkzeug verwendet werden kann mit dem sich die Freisetzung von Antikörpern verzögern lässt. Während die in-vitro Freisetzung von Bevacizumab aus unmodifizierten DA-Hydrogelen bereits nach 10 Tagen abgeschlossen war, sorgte die hydrophobe Modifikation für eine Verzögerung der Freisetzung für 30 Tage im Falle der C6 Kette und nahezu 60 Tage im Falle der C12 Kette (Kapitel 3).
Obwohl die Gelierungszeit mittels hydrophober Assoziation signifikant reduziert werden konnte, konnte eine sofortige Gelbildung mit diesem Ansatz nicht erreicht werden. Um DA-Hydrogele zu entwickeln, die eine sofortige Gelbildung zeigen wurde daher ein Dualgelierungskonzept verfolgt. Anstatt achtarmiger PEGs wurden vierarmige Poloxamine verwendet und mit Maleinimid und Furan Gruppen modifiziert. In wässriger Umgebung zeigten diese Makromonomere eine sofortige Gelbildung bei Körpertemperatur. Gleichzeitig begannen die funktionellen Endgruppen das Hydrogel zusätzlich kovalent querzuvernetzen. Auf diese Weise wurde der schnelle Sol-Gel Übergang der physikalischen Gelierung mit der Stabilität chemisch quervernetzter Gele in einem Hybridsystem kombiniert. Zusätzlich wurden weitere Verzweigungen in die Moleküle eingebracht um eine vielseitigere Hydrogelplattform zu entwickeln, deren Kerneigenschaften, wie mechanische Festigkeit und Stabilität, maßgeschneidert werden können. So konnte die Stabilität dieser Hydrogele präzise im Bereich von 14 bis 329 Tagen eingestellt werden, je nachdem welche Komposition verwendet wurde. Schließlich konnte auch eine kontrollierte in-vitro Freisetzung des Modellantikörpers Bevacizumab über Zeiträume von einer Woche, zwei Wochen und 115 Tagen erzielt werden. Die Freisetzungsprofile zeichneten sich dabei durch einen äußerst geringen "Burst" und drei Phasen aus. Am wichtigsten war jedoch, dass gezeigt werden konnte, dass nahezu die vollständige Menge Antikörper, mit der das Hydrogel beladen worden war auch freigesetzt wurde und circa 87% des freigesetzten Antikörpers funktional binden konnte. Zusammenfassend sind DA-Poloxamin Hydrogele sofort gelierend, mechanisch stabil, abbaubar, nicht toxisch und bieten die Möglichkeit einer kontrollierten Antikörperfreisetzung. Da sich ihre Eigenschaften präzise kontrollieren und so für die Anwendung optimieren lassen, stellen sie ein vielversprechendes Material für die kontrollierte lokale Antikörperfreisetzung dar (Kapitel 4).
Neben der langsamen Gelierung sind Nebenreaktionen mit Proteinen der Hauptnachteil der DA-Hydrogele. Ein möglicher Ansatz um dieses Problem zu lösen, wäre Antikörper in Hydrogel Mikropartikel einzuschließen, um sie vor schädlichen Nebenreaktionen zu schützen. Außerdem könnten solche mit Antikörper beladenen Mikrogele auch Anwendung als Trägersystem finden um eine kontrollierte lokale Freisetzung zu erreichen. Jedoch stellt die Herstellung von antikörperbeladenen Mikrogelen mit enger Größenverteilung und ohne, dass bei der Herstellung die Stabilität der Proteine beeinträchtigt wird, eine große Herausforderung dar. Um dieses Ziel zu erreichen wurde eine Herstellungsmethode gewählt, die Mikrofluidik und Thiol-en Photoklick Chemie kombiniert. Mikrofluidik ist eine gut charakterisierte Methode, um gleichförmige Partikel herzustellen und gleichzeitig eine Methode, die Materialien nur geringen Belastungen aussetzt. Auf der anderen Seite ist die Thiol-en Reaktion bekannt dafür kompatibel mit Proteinen zu sein und kann zudem mittels sichtbaren Lichts in Gang gesetzt werden. Um Mikrogelpartikel herzustellen, wurden zunächst mittels Mikrofluidik Tröpfchen hergestellt, die Antikörper, Makromonomere und weitere Reaktanten enthielten. Im nächsten Schritt wurde grünes Licht verwendet, um die Tröpfchen kovalent querzuvernetzen und so den Antikörper einzuschliessen. Um Mikrogele mit unterschiedlichen Eigenschaften herstellen zu können wurde eine Makromonomerbibliothek mit unterschiedlichen Molekularmassen, sowie labil beziehungsweise stabil gebundenen funktionellen Gruppen synthetisiert. Rheologische Untersuchungen wurden dazu verwendet, die notwendige Bestrahlungszeit und die mechanischen Eigenschaften zu untersuchen. Die hergestellten Mikrogele waren stäbchenformig und eine enge Größenverteilung mit einer ungefähren Breite von 380 μm, und Längen von 1400 μm oder 2150 μm. Bevacizumab wurde erfolgreich in die Mikrogele eingebettet und wurde dann über 28 und 46 Tage kontrolliert freigesetzt. Es wurde bestätigt, dass der entwickelte Prozess die Bindungsfähigkeit von Bevacizumab nicht negativ beeinflusst. Zusammenfassend ist diese Strategie somit eine geeignete Möglichkeit, um Mikrogele mit Antikörpern zu beladen und stellt daher einen interessanten Ausgangspunkt für weitere Entwicklungen dar. In zukünftigen Experimenten sollte die allgemeine Hypothese verifiziert werden, dass Mikrogele verwendet werden können, um vor schädlichen Nebenreaktionen zu schützen. Weiterhin sollten für eine Anwendung als injizierbare oder inhalierbare Arzneistoffträger deutlich kleinere Mikrogele hergestellt werden. Die könnte beispielsweise durch eine genauere Steuerung der Flussgeschwindigkeitsverhältnisse zwischen Silikonöl und Polymerphase erreicht werden oder durch die Verwendung von Schläuchen mit geringerem Durchmesser (Kapitel 5).
Obwohl der Einschluss in Mikrogele eine effektive Möglichkeit sein könnte, um Protein-Polymer Konjugation während der Quervernetzung zu unterbinden, ist dies ein vergleichsweise komplizierter Ansatz. Es wäre ideal, wenn Michael-artige Reaktionen von Maleinimid durch einfaches Hinzufügen eines protektiven Hilfsstoffes verhindert werden könnte. Zu diesem Zweck wurden eine Reihe pharmazeutisch relevanter Polyanionen untersucht, d.h. Alginat, Dextransulfat, Heparin, Hyaluronsäure, und Polyacrylsäure. Elektrostatische Interaktionen führten zu einer reversiblen Bindung der Polyanionen an die Proteinoberfläche. Dadurch konnte die Reaktion von Maleinimid mit nukleophilen Gruppen auf der Proteinoberfläche unterbunden werden. Dies konnte durch eine Simulation der Quervernetzungsbedingungen mit monofunktionalem mPEG5k-Maleinimid und mPEG5k-Furan unter Verwendung des Modellproteins Lysozym gezeigt werden. Zum Beispiel war bei pH 7.4 ohne Polyanionen 61% des Lysozyms PEGyliert und die Aktivität sank auf etwa 20% des Ausgangswertes. Zum Vergleich verblieb durch Zusatz von Dextransulfat eine Aktivität von 98% und keine PEGylierung war detektierbar. Insgesamt wurden Dextransulfat, Heparin und Polyacrylsäure als potenteste Additive identifiziert, um Proteine während der Quervernetzung zu schützen. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass der Schutzeffekt ausschließlich auf elektrostatischen Wechselwirkungen basiert, da er durch die Zugabe hoher Salzkonzentrationen aufgehoben werden konnte. Außerdem wurde nachgewiesen, dass der protektive Effekt sowohl in saurer, neutraler als auch basischer Umgebung wirksam ist, was ihn zu einem vielseitigen Werkzeug für Proteinformulierung und Delivery macht. Um Proteine optimal vor ungewünschten Nebenreaktionen zu schützen, sollte die Quervernetzung immer in saurem Milieu und nach Zusatz von Polyanionen durchgeführt werden. Diese Bedingungen sind optimal, da auf der einen Seite die Reaktivität der nukleophilen Gruppen (z.B. der Amine) reduziert ist und auf der anderen Seite Proteine in saurer Umgebung eine größere positive Ladung tragen, was die Interaktion mit Polyanionen erleichtert (Kapitel 6).
Metadaten zuletzt geändert: 25 Nov 2020 20:46
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