| License: Creative Commons Attribution 4.0 (49MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-364228
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.36422
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Date: | 16 October 2018 |
| Referee: | Prof. Dr. Joachim Wegener |
| Date of exam: | 5 December 2017 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik Chemistry and Pharmacy > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik > Bioanalytik und Biosensorik (Prof. Joachim Wegener) |
| Keywords: | Impedanzsspektroskopie, leitfähige Polymere, bipolare Elektroden, Derivativimpedanzspektroskopie, Zellanalyse, ECIS |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 500 Natural sciences & mathematics |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 36422 |
Abstract (English)
This thesis focused on the advancement of impedance-based cellular assays using the electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) approach. Three linchpins of ECIS were addressed: electrode material, electrode design, and data analysis. Typically, ECIS measurements are performed by application of ac currents with low amplitude between coplanar gold-film electrodes with adherent cell monolayers ...
Abstract (English)
This thesis focused on the advancement of impedance-based cellular assays using the electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) approach. Three linchpins of ECIS were addressed: electrode material, electrode design, and data analysis. Typically, ECIS measurements are performed by application of ac currents with low amplitude between coplanar gold-film electrodes with adherent cell monolayers growing on top. Different chapters of this work discussed the replacement of the electrode material gold by a conducting polymer, the use of a single bipolar electrode instead of two separate electrodes, and the data analysis by means of the derivatives of impedance spectra.
The first part of this work dealt with the fabrication and characterization of screen printed polymer electrode arrays. The arrays, called PDT, were based on the conducting polymer PEDOT:PSS as electrode material, silver leads to reduce the lead resistance, and a silicone passivation layer to delineate the electrode dimensions. The electrodes showed high adhesion stability in aqueous environment at 37 °C, electrical stability in the analytically relevant voltage range between 10 mV and 300 mV, and long-term stability when stored in ambient air in the dark. In comparison with gold electrodes, PEDOT:PSS exhibited a greatly enhanced interface capacitance due to its hydrogel properties. This improved the sensitivity of the impedance magnitude |Z| and the real component of the impedance R at lower frequencies for cell analysis, which is relevant for the analysis of the barrier function and the cell-substrate interaction of adherent cell monolayers. Cell proliferation and adhesion assays are commonly conducted by monitoring the capacitance at 32 kHz or 40 kHz. In this frequency range, the sensitivity of the polymer electrodes surpassed the gold electrodes. A disadvantage of PEDOT:PSS was its high resistivity and thus the high lead resistance, reducing the sensitivities for the parameters |Z| and R at higher frequencies. Alterations in the cell-substrate contact as well as the adhesion and spreading kinetics compared to commercial gold electrodes were discussed with respect to the lower substrate stiffness of PEDOT:PSS compared to gold. Several common analytical assays investigating the micromotion, proliferation, cytotoxicity, and electroporation performance of the PEDOT:PSS electrodes were successfully conducted on both electrode materials, yielding overall similar results. Nevertheless, several differences were established. Due to the high interface capacitance, the PEDOT:PSS electrodes showed an extremely low noise level during micromotion experiments compared to the gold electrodes. This resulted in accordingly high signal-to-noise ratio and sensitivity. The proliferation assay provided more data scattering on PEDOT:PSS electrodes, which could be either attributed to the smaller electrode size or an inhomogeneous distribution of the substrate stiffness across the electrode surface. Due to a reduced generation of cytotoxic species at the electrode surface, the electroporation at lower frequencies (1.5 kHz) was found to be less invasive on PDT electrodes. Different cell lines with individual cell parameters were shown to retain their specific characteristics concerning barrier function, cell-substrate contact, and membrane capacitance on PEDOT:PSS. A remaining challenge is the electrode drift that occurred over the course of several days during the measurement. The drift was less pronounced in the impedance magnitude and appeared more prominently in the capacitance.
In the second part of this work, a novel bipolar electrode for impedimetric analysis and manipulation of living cells was developed. The bipolar electrode consisted of a high-resistance conduction path showing a potential gradient along its length. The potential at the respective position on the electrode surface depended on its distance from the contact pads. Thus, upon application of elevated electric fields of 5 V for 60 s, the bipolar electrodes caused a gradient of increasing electric field strength along the conduction path. This property of the bipolar electrodes was explained by an increasing lead resistance with growing distance from the contact pads. The system is suggested to be suitable for the optimization of wounding and electroporation experiments as the position on the electrode indicates the optimal voltage amplitude required for the respective application. In a second approach, bipolar electrodes were fabricated comprising a passivation layer with a small working and a large counter electrode like in the ECIS layout. For this layout, a mathematical model based on the ECIS model was developed. Using this model, it was shown that the low frequency part of the impedance magnitude spectrum was determined by the inherent resistance of the bipolar electrode. Compared to ECIS electrodes, the bipolar electrodes showed a sensitivity shift from the real part to the imaginary part of the complex impedance.
The third part of this work aimed to improve the accuracy of data analysis for impedance spectroscopy by calculating the derivatives of the spectra. Therefore, a set of methods was developed to analyze the applicability of derivative impedance spectroscopy (DIS) for the analysis of impedance-based cellular assays. Artificial raw data with known electrode and cell parameters were created by overlaying simulated impedance spectra with computer-generated noise. The derivative orders zero to three of these spectra were fitted using different settings of the fitting conditions and weighting methods. For a quantitative evaluation, the parameter Qrel was introduced, which is a direct measure for the quality of a fit. For certain fitting conditions the first derivative displayed some improvement compared to the zero-order spectrum. However, the overall tendency was a strong decline of the fit quality with increasing derivative order. This was found to be due to insufficient reduction of the noise, which is amplified after each differentiation. In a second approach, DIS was used to discriminate between spectral changes caused by alterations of either one of the cell parameters, α or Rb. Fixed frequencies were found, where simulations showed more distinct differences in the first or second derivative than in the zero-order spectrum. In particular, the first and second derivative exhibited opposing tendencies for the two cell parameters at 400 Hz and 1 kHz, respectively. Moreover, the migration of the zero-points of the second derivative when varying the cell parameters might become useful in a similar fashion. The high-frequency zero-point (~ 10 kHz) was shown to migrate only upon alteration of Rb and was unaffected by α. The results presented in this chapter are only valid for the investigated system and are not applicable to other cell lines.
Translation of the abstract (German)
Das Ziel dieser Arbeit war die Weiterentwicklung der impedimetrischer Verfahren zur Analyse lebender adhärenter Zellen in vitro mittels Electric Cell-Substrate Impedance Sensing (ECIS). Dabei standen drei zentrale Themenbereiche dieses Ansatzes im Fokus: das verwendete Elektrodenmaterial, das Elektrodendesign und die Datenanalyse. Typischerweise werden ECIS-Messungen durch Anlegen niedriger ...
Translation of the abstract (German)
Das Ziel dieser Arbeit war die Weiterentwicklung der impedimetrischer Verfahren zur Analyse lebender adhärenter Zellen in vitro mittels Electric Cell-Substrate Impedance Sensing (ECIS). Dabei standen drei zentrale Themenbereiche dieses Ansatzes im Fokus: das verwendete Elektrodenmaterial, das Elektrodendesign und die Datenanalyse. Typischerweise werden ECIS-Messungen durch Anlegen niedriger Wechselspannungen zwischen coplanaren Goldfilmelektroden, auf welchen monolagige Zellschichten wachsen, durchgeführt. In den einzelnen Kapiteln dieser Arbeit werden der Ersatz von Gold als Elektrodenmaterial durch ein leitfähiges Polymer, die Verwendung einer einzelnen bipolaren Elektrode an Stelle zweier getrennter Elektroden, sowie die Datenauswertung mittels der Ableitungen von Impedanzspektren diskutiert.
Der erste Teil dieser Arbeit behandelte die Herstellung von Polymerelektrodenarrays mittels des Siebdruckverfahrens und deren Charakterisierung. Das leitfähige Polymer PEDOT:PSS diente als Elektrodenmaterial. Ferner wurden Silber-Zuleitungen verdruckt um den Zuleitungswiderstand zu reduzieren, sowie eine Passivierungsschicht aus Silikon, welche die Größe und Form der Elektroden festlegte. Die Elektroden zeigten hohe Adhäsionsstabilität in wässriger Umgebung bei 37 °C, elektrische Stabilität im analytisch relevanten Spannungsbereich zwischen 10 mV und 300 mV und Langzeitstabilität bei Lagerung unter Lichtausschluss. Aufgrund seiner Hydrogel-Eigenschaften wies PEDOT:PSS eine wesentlich größere Grenzflächenkapazität als Gold auf. Dadurch wurde die Sensitivität des Betrags |Z| sowie des Realteils R der Impedanz bei niedrigen Frequenzen beträchtlich gesteigert, was für die Analyse der Barrierefunktion und der Zell-Substrat-Wechselwirkung adhärenter Zellschichten von Bedeutung ist. Zelluläre Proliferations- und Adhäsionsassays werden normalerweise durch zeitaufgelöste Messung der Kapazität bei 32 kHz oder 40 kHz verfolgt. In diesem Frequenzbereich überstieg die Sensitivität der Polymerelektroden die der Goldelektroden. Der hohe spezifische Widerstand von PEDOT:PSS sowie der sich daraus ergebende Zuleitungswiderstand führte jedoch zu einer verminderten Sensitivität der Messgrößen |Z| und R bei hohen Frequenzen im Vergleich zu den Goldfilm-Elektroden als Benchmark. Unterschiede am Zell-Substrat-Kontakt und in der Adhäsions- und Spreitkinetik der Zellen im Vergleich zu kommerziellen Goldelektroden wurden im Zusammenhang mit dem geringeren Härtegrad von PEDOT:PSS im Vergleich zu Gold diskutiert. Verschiedene etablierte, zell-basierte Assays wie Micromotions-, Proliferations-, Zytotoxizitäts- und Elektroporationsstudien wurden erfolgreich mit beiden Elektrodenmaterialien durchgeführt und führten im Allgemeinen zu ähnlichen Ergebnissen. Dennoch konnten einige Unterschiede festgestellt werden. Die PEDOT:PSS-Elektroden zeigten bei Micromotion-Messungen verglichen mit Goldelektroden ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis und dadurch eine verbesserte Sensitivität. Dies lag in der hohen Grenzflächenkapazität begründet, welche mit einem niedrigen Rauschpegel einhergeht. Der Proliferationsassay ergab unregelmäßigere Kurvenverläufe mit PEDOT:PSS-Elektroden, was mit der geringeren Elektrodengröße oder einer inhomogenen Verteilung der Substrathärte über die Elektrodenfläche erklärt werden könnte. Durch eine reduzierte Produktion zytotoxischer Spezies an der Elektrodenoberfläche unter Einwirkung invasiver Spannungen zeigte sich die Elektroporation bei niedrigen Frequenzen (1.5 kHz) weniger invasiv bei der Verwendung von PEDOT:PSS-Elektroden. Verschiedene Zelllinien mit individuellenZellparametern behielten ihre spezifischen Eigenschaften bezüglich Barrierefunktion, Zell-Substrat-Kontakt und Membrankapazität auf PEDOT:PSS bei. Eine Herausforderung für zukünftige Anwendungen ist der Elektrodendrift, welcher bei Impedanzmessungen über mehrere Tage hinweg auftrat. Der Drift war beim Betrag der Impedanz nur schwach ausgeprägt, trat bei der Kapazität jedoch stärker in den Vordergrund.
Im zweiten Teil der Arbeit wurde eine neuartige bipolare Elektrode gleichermaßen für die impedimetrische Analyse und Manipulation lebender Zellen entwickelt. Die beschriebene bipolare Elektrode bestand aus einem Leitungspfad mit hohem Eigenwiderstand, woraus sich ein Potentialgradient entlang des Leitungspfades entwickelt. Untersuchungen zeigten, dass das Potential an der jeweiligen Position auf der Elektrode vom Abstand von den Kontaktabgriffen am Ende der Leiterstruktur abhing. Durch Anlegen starker elektrischer Felder von 5V über 60 s verursachten die bipolaren Elektroden dadurch einen Spannungsgradienten entlang des Leitungspfades, der mit zunehmender Invasivität des elektrischen Feldes einherging. Diese Eigenschaft der bipolaren Elektroden wurde durch den ansteigenden Zuleitungswiderstand mit zunehmendem Abstand von den Kontakten an den Enden der Leiterstruktur erklärt. Ein mögliches Anwendungsgebiet stellt die Optimierung von Verwundungs- und Elektroporationsexperimenten dar, da anhand der Position auf der Elektrode die optimale Spannung, welche für die jeweilige Anwendung benötigt wird, erkennbar ist. Weiterhin wurden bipolare Elektroden hergestellt, welche wie beim ECIS-Layout eine Passivierungsschicht mit Öffnungen für eine kleine Arbeitselektrode und eine größere Gegenelektrode enthielten. Für dieses Elektrodendesign konnte ein auf dem ECIS-Modell basierendes physikalisches Modell entwickelt werden. Durch Anwendung dieses Modells wurde gezeigt, dass der niederfrequente Bereich in den Spektren des Betrags der Impedanz und des Realteils allein durch den Eigenwiderstand der bipolaren Elektrode bestimmt wird. Darüber hinaus wiesen die bipolaren Elektroden im Vergleich zu den ECIS-Elektroden eine Verschiebung der Sensitivität vom Realteil zum Imaginärteil der komplexen Impedanz auf.
Der dritte Teil dieser Arbeit hatte das Ziel, die Genauigkeit der Datenanalyse bei der Durchführung impedanz-basierter Assays durch Berechnung der Ableitungen der Impedanzspektren zu erhöhen. Dafür wurde eine Methode entwickelt, um die Derivativimpedanzspektroskopie (DIS) auf die Verwendbarkeit bei der impedimetrischen Untersuchung lebender Zellen hin zu untersuchen und zu charakterisieren. Künstliche Rohdaten mit bekannten Elektroden- und Zellparametern wurden erstellt, indem simulierte Impedanzspektren mit computergeneriertem Rauschen überlagert wurden. Um eine quantitative Evaluierung zu ermöglichen, wurde der Parameter Qrel eingeführt, welcher ein direktes Maß für die Qualität eines Fits ist. Für bestimmte Einstellungen des Fit-Algorithmus zeigte die erste Ableitung Verbesserungen im Vergleich zum Spektrum nullter Ordnung. Allerdings wurde allgemein ein starker Abfall der Fitqualität mit zunehmender Ordnung der Ableitung beobachtet. Dies wurde auf eine ungenügende Glättung des sich mit jeder Ableitung verstärkenden Rauschens zurückgeführt. In einem zweiten Ansatz wurde die DIS verwendet, um zwischen spektralen Veränderungen zu unterscheiden, die durch die Zellparameter α oder Rb verursacht wurden. An bestimmten Frequenzen stellten die erste und zweite Ableitung die Unterschiede deutlicher heraus als das Spektrum nullter Ordnung. Insbesondere zeigten die erste und zweite Ableitung für Änderungen der Zellparameter gegenläufige Trends bei 400 Hz bzw. 1 kHz. Darüber hinaus konnte die Migration der Nullstellen in der zweiten Ableitung auf ähnliche Weise verwendet werden. Die hochfrequente Nullstelle bei etwa 10 kHz verschob sich nur durch Veränderungen von Rb, blieb aber unbeeinflusst durch α. Die in diesem Kapitel gezeigten Ergebnisse gelten ausschließlich für das hier untersuchte System und sind nicht auf andere Zelllinien übertragbar.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 20:43
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