| License: Creative Commons Attribution 4.0 PDF - Accepted Version (27MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-364582
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.36458
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 14 December 2017 |
| Referee: | Prof. Dr. rer Inga Neumann |
| Date of exam: | 8 December 2017 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Zoologie > Tierphysiologie/Neurobiologie (Prof. Dr. Inga Neumann) |
| Keywords: | neuropeptides, DREADD, NPS, oxytocin, anxiety, signaling, GCAMP6s, FACS, microdialysis |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 590 Zoological sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 36458 |
Abstract (English)
Anxiety is a natural response to a real or perceived threat that has been conserved throughout evolution. From this perspective, sensation of anxiety is viewed as an adaptive behavioral state, which occurs in response to signals of danger. However, excessive or inappropriate anxiety can become pathological. Anxiety disorders represent one major burden of our modern society, and the available ...
Abstract (English)
Anxiety is a natural response to a real or perceived threat that has been conserved throughout evolution. From this perspective, sensation of anxiety is viewed as an adaptive behavioral state, which occurs in response to signals of danger. However, excessive or inappropriate anxiety can become pathological. Anxiety disorders represent one major burden of our modern society, and the available treatment options are limited by adverse side effects. During the last decades, research centered on anxiety disorders has focused on neuropeptides. Neuropeptide S (NPS) and oxytocin (OXT) represent potential neuropeptide candidates for the treatment of various psychopathologies, including anxiety disorders due to their potent anxiolytic profile. Both signal through G protein-coupled receptors and thereby regulate complex neuronal signaling pathways. How these pathways contribute to behavioral and physiological effects of NPS and OXT remains to be elucidated. Therefore, in the present thesis I aimed to reveal, (i) whether NPS acts on the brain OXT system to exert its anxiolytic properties, (ii) whether the anxiolytic profile of NPS is mediated in a Gq pathway-dependent manner, and (iii) to characterize the spatiotemporal characteristics of chemogenetically induced OXT neurons activation.
NPS receptors (NPSR) are found within the hypothalamic paraventricular nucleus (PVN), where OXT is synthesized besides the supraoptic and accessory nuclei. Besides anxiolysis, NPS and OXT share other effects, such as the reversal of social fear, the attenuation of aggressive-like behavior as well as the inhibition of food-intake and anti-nociceptive properties as demonstrated in rodents. These behavioral similarities, together with the neuroanatomical overlapping of the NPSR and OXT expression within the PVN, led me to hypothesize that NPS effects are mediated by acting on the OXT system within the PVN. Herein, I present a chain of evidence that the effects of NPS within the PVN are mediated via actions on local OXT neurons in male Wistar rats. Retrograde tracing revealed that NPS-immunoreactive neurons originating within the Locus coeruleus innervate the PVN. Moreover, fluorescence-activated cell sorting identified NPSR expression in PVN-OXT neurons. NPS reliably induced transient Ca2+-influx in a subpopulation of OXT neurons - an effect mediated via the NPSR. Moreover, intracerebroventricular (icv) NPS evoked a significant release of OXT within the PVN as assessed by microdialysis in combination with a highly sensitive radioimmunoassay. Both, chemogenetic silencing of the endogenous OXT system using designer receptors exclusively activated by designer drugs (DREADD) as well as pharmacological blockade of brain OXT receptors (OXTR) abolished the anxiolytic effect of NPS infused icv. These findings provide the first evidence for an intra-hypothalamic mechanism involving NPSR-expressing OXT neurons in the potent anxiolytic profile of NPS, and fill an important gap in our neurophysiological understanding of brain neuropeptide interactions in the context of regulation of emotional behaviour within the hypothalamus.
Next, I performed studies in order to extend our knowledge on the intraneuronal mechanisms underlying the anxiolytic profile of NPS by studying signaling pathways downstream of NPSR activation. Here, bilateral microinfusion of NPS into the medial amygdala (MeA) of male adult Wistar rats reduced anxiety-related behavior on the elevated plus maze and the open field. Moreover, icv infusion of NPS evoked expression as well as increased phosphorylation of Ca2+/calmodulin-dependent kinase II in the amygdala, and subsequent phosphorylation of the mitogen-activated protein kinase ERK1/2. Importantly, NPS-induced anxiolysis in the MeA was prevented by local inhibition of phospholipase C using the specific inhibitor U73122. In contrast, local pharmacological blockade of adenylyl cyclase signaling using the specific inhibitor 2’,5’-dideoxyadenosine failed to inhibit the anxiolytic effect of NPS infused into the MeA. Hence, NPS promotes acute anxiolysis within the MeA dependent on NPSR-mediated phospholipase C signaling.
Finally, in order to validate an innovative and highly specific tool for activating OXT neurons within the PVN in a behavioral context, I performed a series of experiment using the DREADD technique. Acute chemogenetic activation of PVN-OXT neurons resulted in enhanced release of OXT within the PVN within one hour as assessed using intracerebral microdialysis. Further, DREADD activation reduced anxiety-related behavior in the light/dark box, and increased self-grooming behavior in the home cage. In addition, chemogenetic activation of PVN-OXT neurons marginally improved ethanol-induced locomotor deficits.
In summary, my experimental data advance our understanding of the mechanisms by which NPS promotes anxiolysis and the temporal release patterns of OXT following chemogenetic activation and its behavioral relevance.
Translation of the abstract (German)
Aus evolutionsbiologischer Sicht ist Angst eine konservierte, natürliche Reaktion auf eine reale oder gefühlte Bedrohung. Allerdings können exzessive bzw. unangepasste Angstzustände ein pathologisches Ausmaß annehmen. Angsterkrankungen repräsentieren daher eine der Hauptbelastungen unserer modernen Gesellschaft. Da die derzeitigen Behandlungsmethoden limitiert und von Nebenwirkungen geprägt sind, ...
Translation of the abstract (German)
Aus evolutionsbiologischer Sicht ist Angst eine konservierte, natürliche Reaktion auf eine reale oder gefühlte Bedrohung. Allerdings können exzessive bzw. unangepasste Angstzustände ein pathologisches Ausmaß annehmen. Angsterkrankungen repräsentieren daher eine der Hauptbelastungen unserer modernen Gesellschaft. Da die derzeitigen Behandlungsmethoden limitiert und von Nebenwirkungen geprägt sind, rückten Neuropeptide in den letzten Jahrzehnten mehr und mehr in den Fokus der Wissenschaft. Aufgrund ihrer potenten, angstlösenden Wirkung repräsentieren Neuropeptid S (NPS) und Oxytocin (OXT) zwei mögliche Kandidaten zur Behandlung von Angsterkrankungen. Beide Neuropeptide binden an G-Protein-gekoppelte Rezeptoren und regulieren dadurch komplexe neuronale Signalwege. Daher war das Ziel meiner Doktorarbeit zu erforschen (i) welchen Einfluss OXT-Neurone im Hypothalamus auf die angstlösende Wirkung von NPS haben, (ii) welche intrazellulären Signalkaskaden der anxiolytischen Wirkung von NPS zugrunde liegen, und (iii) den zeitlichen Ablauf einer chemogenetischen Aktivierung der OXT-Neurone zu charakterisieren.
NPS-Rezeptoren (NPSR) werden im hypothalamischen Nucleus paraventricularis (PVN) exprimiert und zeigen eine morphologische Überlappung mit OXT-Neuronen, die sowohl im PVN also auch dem Nucleus supraopticus und den Nucleus accessorius lokalisiert wurden. Neben ihrer angstlösenden Wirkung reduzieren sowohl NPS als auch OXT soziale Angst und aggressives Verhalten in Ratten und Mäusen. Darüber hinaus mindern beide Neuropeptide die Nahrungsaufnahme und hemmen die Schmerzwahrnehmung in Ratten. Aufgrund der ähnlichen Verhaltenseffekte beider Neuropeptide sowie der neuroanatomischen Überlappung der neuronalen NPSR- und OXT-Expression untersuchte ich die Fragestellung, ob NPS-induzierte Effekte über das Oxytocin-System im PVN vermittelt werden. Mittels einer retrograden Markierung konnte ich zeigen, dass NPS-immunoreaktive Neurone aus dem Locus coeruleus zum PVN projizieren. Darüber hinaus bewies Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung, dass der NPSR in OXT-Neuronen des PVN exprimiert wird. In einer Subpopulation von OXT-Neuronen induzierte NPS durch die Bindung an seinen Rezeptor einen Anstieg des intrazellulären Calcium-Spiegels. Durch intrazerebrale Mikrodialyse in Verbindung mit einem hochsensitiven Radioimmunoassay für OXT konnte ich zeigen, dass NPS die somato-dendritische Freisetzung von OXT im PVN erhöht. Um einen kausalen Zusammenhang zwischen der NPS-induzierten Stimulation der OXT-Neurone und deren Effekt auf die angstlösende Wirkung von NPS zu untersuchen, habe ich eine chemogenetische Inhibierung der OXT-Neurone sowie eine pharmakologische Blockade der OXT-Rezeptoren (OXTR) durchgeführt. Meine Ergebnisse demonstrieren, dass das OXT-System im PVN eine essentielle Rolle für die angstlösende Wirkung von NPS spielt.
Um das Wissen über die intraneuronalen Wirkmechanismen von NPS zu erweitern, habe ich die NPSR-gekoppelten Signalwege untersucht. Meine Experimente zeigten, dass eine bilaterale Mikroinfusion von NPS in den Nucleus amygdalae medialis (MeA) das Angstverhalten männlicher Wistar-Ratten sowohl auf der elevated plus maze als auch in der open field box reduziert. Zusätzlich demonstrierten die Untersuchungen, dass icv infundiertes NPS zur Expression und Phosphorylierung der Calcium/Calmodulin-abhängigen Kinase II und zur Phosphorylierung der Mitogen-aktivierten Proteinkinase ERK1/2 in der Amygdala führt. Durch die Inhibierung der Phospholipase C mittels des spezifischen Blockers U73122 wurde die NPS-induzierte Anxiolyse gehemmt. Im Gegensatz dazu verhinderte die pharmakologische Blockade der Adenylatcyclase nicht die angstlösende Wirkung von NPS. Daher kann geschlussfolgert werden, dass die akute NPS-induzierte Anxiolyse von einem Phospholipase C-gekoppelten Signalweg in der MeA abhängig ist.
Im Hinblick auf die Validierung einer innovativen und hoch spezifischen Methode zur Aktivierung der OXT-Neurone im PVN und den damit verbundenen Verhaltenskontext, habe ich die zeitliche Abfolge einer chemogenetischen Stimulation der OXT-Neurone untersucht. Dadurch konnte ich zeigen, dass die chemogenetische Aktivierung innerhalb einer Stunde zum Höhepunkt der OXT-Freisetzung führt, das Angstverhalten in der Light/Dark Box mindert und zu einer Zunahme des Putzverhaltens führt. Darüber hinaus untersuchte ich den Einfluss der chemogenetisch aktivierten OXT-Neurone auf die Bewegungsaktivität während eines Alkohol-induzierten Rauschzustandes. Hierbei hatte die endogene OXT-Freisetzung allerdings nur einen marginal förderlichen Effekt auf den Bewegungsablauf.
Zusammengefasst erweitern meine experimentellen Ergebnisse unser Verständnis im Hinblick auf den zugrundliegenden Mechanismus, der zur NPS-induzierten Anxiolyse führt, und den zeitlichen Verlauf der chemogenetisch induzierten Aktivierung von OXT-Neuronen im PVN sowie deren Einfluss auf definierte Verhaltensweisen.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 20:40
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