| License: Creative Commons Attribution 4.0 (10MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-354425
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.36956
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Date: | 3 April 2018 |
| Referee: | Prof. Dr. Joachim Wegener |
| Date of exam: | 17 March 2017 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik > Bioanalytik und Biosensorik (Prof. Joachim Wegener) |
| Keywords: | Impedance Spectroscopy, tissue models, Flow channel, spheroids |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 36956 |
Abstract (English)
The use of 3D tissue models is an emerging branch of cell-based in vitro assays. However, the advancement of appropriate readout techniques capable of reaching into the center of those cell aggregates proceeds rather slowly. This thesis addresses the characterization and testing of a new impedance-based device to analyze 3D multicellular spheroids non-invasively and label-free. The new device ...
Abstract (English)
The use of 3D tissue models is an emerging branch of cell-based in vitro assays. However, the advancement of appropriate readout techniques capable of reaching into the center of those cell aggregates proceeds rather slowly.
This thesis addresses the characterization and testing of a new impedance-based device to analyze 3D multicellular spheroids non-invasively and label-free. The new device consists of a flow channel with a central aperture that is sealed by the spheroid. ITO electrodes positioned at the bottom of the two channel reservoires enable the EIS analysis of the trapped spheroid in the flow channel. The channel and the electrode layout are made of transparent material and therefore allow spheroid imaging within the channel.
The flow channel can be cleaned easily and re-used several times. Spheroid introduction into the channel and positioning in front of the central aperture by fluid flow is straightforward. Upon spheroid introduction and subsequent sealing of the aperture the impedance of the channel is significantly increased compared to the impedance of a spheroid-free channel. The overall impedance of the setup is dominated by the dielectric properties of the spheroid and allows for its detailed analysis. Spheroids with the same age and formed from the same seeding density as well as repositioned spheroids showed reproducible impedance characteristics. By implementation of a transfer function in a LabView-based software describing the equivalent circuit model of a spheroid in the EIS device it is possible to quantify the dielectric properties of spheroids. These are described by the three spheroid parameters: (i) Rext, reflecting the extracellular resistance caused by the current flow around cellular bodies and through the extracellular matrix, (ii) the intracellular resistance Rint caused by the resistivity of the cytoplasm and (iii) the non-ideal total capacitance Asph of the cell membranes.
For proof-of-concept studies MCF-7 tumor spheroids, P19 embryonic bodies and Cor.At® cardiospheres were prepared preferentially by cell aggregation on a non-adhesive surface in a 96-well plate, as it reproducibly generates spheroids of defined size. The tumor spheroids were used to study their morphological alterations upon exposure to invasive stimuli (PFA, saponin, osmotic pressure, cytochalasin D, hyperthermia, irradiation after CaAM or C-dot loading of spheroids). Spheroid injury or death is reflected by a decrease in micromotion (V32), overall impedance and the spheroid parameters Rext and Rint, whereas Asph shows individually different changes. Cardiospheres were investigated based on their beating behavior. Their response to well-known contraction enhancing or inhibiting substances was measured successfully and along physiological mechanisms. Embryonic bodies were used to study their differentiation into cardiomyocytes and neurons. However, due to inefficient differentiation, no distinct changes in impedance were observed.
In summary, the impedance-based flow channel is a label-free, non-invasive and time resolved new readout technique to monitor 3D tissue models and their changes within biomedical experiments.
Translation of the abstract (German)
In Zell-basierten Analyseverfahren werden 2D planare Zellmodelle zunehmend durch 3D Gewebemodelle ersetzt. Die Weiterentwicklung und Anpassung der Auslesemethoden, um das neue Modellsystem bis zu seinem Kern zu analysieren ist jedoch ein langwieriger Prozess. In dieser Arbeit wird ein neu entwickeltes Impedanz-basiertes Messsystem zur nichtinvasiven und markierungsfreien Analyse von 3D ...
Translation of the abstract (German)
In Zell-basierten Analyseverfahren werden 2D planare Zellmodelle zunehmend durch 3D Gewebemodelle ersetzt. Die Weiterentwicklung und Anpassung der Auslesemethoden, um das neue Modellsystem bis zu seinem Kern zu analysieren ist jedoch ein langwieriger Prozess.
In dieser Arbeit wird ein neu entwickeltes Impedanz-basiertes Messsystem zur nichtinvasiven und markierungsfreien Analyse von 3D multizellularen Sphäroiden vorgestellt und dessen Anwendbarkeit geprüft. Bei dem neuen Messsystem handelt es sich um einen Fließkanal mit zentraler Engstelle, an der das Sphäroid zurückgehalten wird und zur Abdichtung des Kanals führt. Planare ITO Elektroden die sich jeweils am Boden der beiden Reservoire befinden ermöglichen die Impedanz-basierte Analyse des Sphäroids im Kanal. Die Verwendung von transparenten Materialien zur Herstellung des Kanals und des planaren Elektrodenlayouts ermöglicht die Beobachtung des Sphäroids im Kanal durch verschiedene mikroskopische Bildgebungsverfahren.
Weitere Vorteile des Systems sind die unkomplizierte Reinigung und die mehrfache Wiederverwendbarkeit des Fließkanals sowie die einfache Einführung und Positionierung des Sphäroids an der zentralen Engstelle im Kanal mithilfe des Flüssigkeitsstroms. Durch das Einbringen eines Sphäroids in den Kanal und die darauf folgende Abdichtung an der Engstelle wird ein signifikanter Anstieg der Impedanz gegenüber dem Sphäroid-freien Kanal ausgelöst. Die Gesamt-impedanz des Kanals wird von den dielektrischen Eigenschaften des Sphäroids dominiert und ermöglicht eine genaue Impedanz-basierte Analyse.
Sphäroide gleichen Alters und gleicher Aussaatdichte sowie repositionierte Sphäroide zeigten reproduzierbare Impedanzeigenschaften. Zur Untersuchung der dielektrischen Eigenschaften eines Sphäroids werden die erhaltenen Impedanzspektren mit Hilfe von Ersatzschaltbildern analysiert. Die dielektrischen Eigenschaften des Sphäroids werden von drei Parametern beschrieben. Dabei handelt es sich unter anderem um den extrazellulären Wiederstand Rext, der durch den Stromfluß um die Zellen und durch die extrazelluläre Matrix verursacht wird. Weitere Parameter sind der intrazelluläre Wiederstand Rint, der vom Wiederstand des Zytoplasmas verursacht wird, sowie die nicht ideale gesamte Kapazität Asph aller Zellmembranen im Sphäroid.
Für die Durchführung von Modellstudien wurden MCF-7 Tumorsphäroide, P19 embryonic bodies und Cor.At® Cardiosphäroide verwendet. Diese wurden bevorzugt mit Hilfe der Methode der nicht-adhäsiven Oberflächenkultur in der 96-well Platte hergestellt, da die Sphäroide nach dieser Methode mit definierten Durchmessern reproduzierbar hergestellt werden konnten. Tumor Sphäroide, die durch verschiedene invasive Stimulantien (PFA, Saponin, osmotischer Stress, Cytochalasin D, Hyperthermie, Bestrahlung von Sphäroiden nach CaAM or C-dot Beladung) beschädigt oder abgetötet wurden, zeigten generell eine Abnahme der micromotion (V32), der Impedanz und der Sphäroidparameter Rext and Rint, während Asph individuelle Änderungen verzeichnete. Der Einfluss von bekannten Reagenzien zur Steigerung oder zur Inhibierung der Kontraktionsfähigkeit von Cardiosphäroiden konnte anhand eines stark veränderten Kontraktionsmusters eindeutig nachgewiesen werden. Embryonic bodies, die eigentlich hinsichtlich ihrer Differenzierung in Cardiomyozyten und neuronale Zellen untersucht wurden, zeigten keine Impedanzänderungen aufgrund von unzureichender Differen-zierung.
Auf Basis der erhaltenen Ergebnisse kann das neue Impedanz-basierte Messverfahren als markierungsfreie, nichtinvasive und zeitlich hochaufgelöste Anaylsemethode für 3D Gewebemodellen angesehen werden, mit der man die dielektrischen Eigenschaften von Sphäroiden und deren Änderung während biomedizinischen Experimenten erfassen kann.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 20:12
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