| Lizenz: Creative Commons Namensnennung 4.0 International (38MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-370064
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.37006
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 26 März 2019 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Dr. Hans Robert Kalbitzer |
| Tag der Prüfung: | 23 März 2018 |
| Zusätzliche Informationen (Öffentlich): | Vollstädniger Autoren-Name: Ferreira Lopes, Rui Pedro |
| Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Dr. Hans Robert Kalbitzer |
| Stichwörter / Keywords: | Ras Protein, Nuclear Magnetic Resonance (NMR), X-ray crystallography, High Pressure |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 530 Physik 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 37006 |
Zusammenfassung (Englisch)
The guanine binding nucleotide protein Ras is a small GTPase that controls central regulatory processes such as cell differentiation, proliferation and apoptosis by alternating between an active, GTP-bound, and an inactive, GDP-bound state. Both, the intrinsic hydrolysis of GTP and the exchange reaction from GDP to GTP are very slow. Two classes of regulatory proteins called GAP’s and GEF’s are ...
Zusammenfassung (Englisch)
The guanine binding nucleotide protein Ras is a small GTPase that controls central regulatory processes such as cell differentiation, proliferation and apoptosis by alternating between an active, GTP-bound, and an inactive, GDP-bound state. Both, the intrinsic hydrolysis of GTP and the exchange reaction from GDP to GTP are very slow. Two classes of regulatory proteins called GAP’s and GEF’s are necessary to accelerate these two respective reactions. Active Ras interacts also with another class of proteins generally called effectors. Using 31P NMR spectroscopy two conformational states that interconvert in the millisecond time scale could be directly observed. They are named state 1(T) and state 2(T) (T or D, depending whether if Tri- or Di-phosphate is bound) and correspond to the GEF and to the effector recognition states, respectively. Their nature is influenced by specific mutations and by the type of bound nucleotide. It was verified that specific somatic mutations render Ras a very potent oncogene. As consequence, the protein becomes insensitive to inactivation by GAP’s and therefore locked in the active state, leading ultimately to uncontrolled cellular proliferation. Approximately 30% of all human tumours are estimated to harbour mutations in one of the three isoforms (H, K and NRas) at positions 12, 13 or 61, with KRas being the most preponderant one. Due to its key role in malignant transformation, efforts have been made over the years to develop effective inhibitors against a seemingly undruggable protein.
In the framework of this thesis, it was demonstrated that KRasWT shows an almost identical behaviour to HRasWT in terms of their intrinsic equilibria. Their 31P NMR spectra is dominated by two conformational states with an equilibrium constant, K12, of 2.0 measured at the g-phosphate of bound GppNHp. The ability to modulate the equilibrium was further addressed by elucidating the mode of action of Zn2+-cyclen. It was shown that this compound can selectively recognise and stabilise state 1(T), disrupting the affinity of both isoforms towards effectors such as Raf-RBD. Titration experiments showed a cooperative binding at two different sites with a Hill coefficient of 2 and an apparent dissociation constant of 9.9 mM for both isoforms.
The inhibition of the oncogenic KRasG12D by a library of 15 different small compounds was further investigated. 31P NMR showed that at least two of them (#755 and #757) led to a significant stabilisation of state 1(T), with more than 70% decrease in the equilibrium constant. A 75% decrease in the affinity of the Ras-Raf complex in the presence of 300 μM of each drug was obtained from ITC measurements. The screening showed that the compounds initially developed for inhibition of Ras bound to GDP are also able to inhibit Ras in the triphosphate-bound form and are good candidates for further lead optimisation. High pressure (HP) 31P NMR was conducted in the isolated GppNHp molecule and in several Ras proteins. For all of them, the pressure-dependence of the chemical shifts revealed to be non-linear as given by the obtained positive values of the second order pressure coefficients, B2. A direct shift of the conformational equilibrium from state 2(T) towards state 1(T), given by the decrease in the equilibrium constant from 1.7 at 0.1 MPa to 0.24 at 250 MPa was observed for RasWT. Additional transitions were detected involving the GAP binding and the nucleotide-free states, named 3(T) and 1(0), respectively.
State 3(T) was identified by 31P NMR upon titration of Ras with NF1 and assigned to the resonance line at d= -3.00 ppm in the spectrum of RasWT•Mg2+•GppNHp. At equimolar concentrations saturation was achieved for the g-phosphate but not for the b-phosphate, supporting the existence of conformational differences in the local environment of this phosphate group upon formation of the protein complex.
Using site-directed mutagenesis and 31P NMR spectroscopy, it was verified that several point mutants (H27E, S39L, E3V and D33K) led to a pronounced modification of the conformational equilibrium. The highest effect was observed for RasD33K•Mg2+•GppNHp that is almost completely shifted towards state 2(T) as given by the increase of the equilibrium constant from 1.7 to 11.3. The mutation is located in the effector-loop region of Ras involved in the interaction with different proteins. A 30-fold decreased affinity towards Raf-RBD (KD= 10.4 μM) comparatively to RasWT (KD= 0.42 μM) and an impaired affinity towards NF1 was observed. The increase of the equilibrium constant from 1.7 to 2.0 in the case of RasE3V represents a good example of a typical conformational modulation by an allosteric mechanism, as the mutation is located in a distal site relative to the bound nucleotide.
The crystal structures of RasWT and RasD33K were solved for the first time under high pressure. Analysis of the unit cell compressibility revealed the existence of a transition zone for RasWT between 200 and 270 MPa. A decrease of the main-chain temperature factors from 20 Å2 at 0.1 MPa to 13.5 Å2 at 650 MPa, together with the increase in the average rmsd values, gave an insight for the possible stabilisation of non-native conformations at high pressures. RasD33K, on the other hand, is less sensitive to pressure, with the transition zone occurring around 500 MPa and significant rearrangements at 880 MPa. Typical pressure-induced modifications involved the helix a2 as part of switch 2, the loop λ7, helix a1 at the beginning of switch 1.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Das Guaninnukleotid-bindende Ras Protein ist eine kleine GTPase, die durch den Wechsel zwischen dem aktiven, GTP-gebundenen Zustand und dem inaktiven, GDP-gebundenen Zustand verschiedene regulatorische Prozesse in der Zelle kontrolliert, wie z.B. Zelldifferenzierung, Zellproliferation und Apoptose. Sowohl die intrinsische Hydrolyse von GTP als auch die Austauschreaktion von GDP zu GTP sind sehr ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Das Guaninnukleotid-bindende Ras Protein ist eine kleine GTPase, die durch den Wechsel zwischen dem aktiven, GTP-gebundenen Zustand und dem inaktiven, GDP-gebundenen Zustand verschiedene regulatorische Prozesse in der Zelle kontrolliert, wie z.B. Zelldifferenzierung, Zellproliferation und Apoptose. Sowohl die intrinsische Hydrolyse von GTP als auch die Austauschreaktion von GDP zu GTP sind sehr langsam. Um diese Reaktionen zu beschleunigen wird die Hilfe der zwei regulatorischen Proteinklassen GAP’s und GEF’s benötigt. Außerdem interagiert Ras in seinem aktiven Zustand mit einer weiteren Proteinklasse, den sogenannten Effektoren. Mit Hilfe der 31P-NMR-Spektroskopie können die zwei Konformationen, deren Umwandlung nur Millisekunden benötigt, direkt detektiert werden. Die beiden Zustände werden als 1(T) und 2(T) bezeichnet (T bzw. D, je nachdem ob Tri- oder Diphosphat gebunden ist) und entsprechen jeweils dem GEF und dem Effektor- erkennenden Zustand. Beeinflusst werden sie durch spezifische Mutationen und durch die gebundene Nukleotidform. Außerdem ist bekannt, dass spezifische somatische Mutationen Ras zu einem potenten Onkogen machen. Als Folge daraus wird das Protein unempfindlich gegen die Inaktivierung durch GAP’s und verbleibt im aktiven Zustand, der zu einer unkontrollierten Zellteilung führt. In 30% aller menschlichen Tumore liegen Mutationen in einer der drei Ras Isoformen (H, K und NRas) in den Positionen 12, 13 oder 61 vor, von denen KRas am häufigsten betroffen ist. Wegen seiner Schlüsselfunktion bei der Tumorbildung wurden im Laufe der letzten Jahre viele Versuche unternommen, um effektive Inhibitoren gegen das scheinbar unbehandelbare Protein zu finden.
Im Rahmen dieser Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass KRasWT und HRasWT ein nahezu identisches Verhalten in Bezug auf ihre intrinsischen Gleichgewichte besitzen. Ihre 31P-NMR-Spektren werden von zwei konformationellen Zuständen dominiert, die eine Gleichgewichtskonstante K12 von 2.0 besitzen, die am g-Phosphat des gebundenen GppNHp bestimmt wurde. Die Möglichkeit dieses Gleichgewicht zu beeinflussen wurde durch den Wirkungsmechanismus von Zn2+-Cyclen verdeutlicht. Es konnte gezeigt werden, dass diese Komponente selektiv den Zustand 1(T) stabilisiert und die Affinität beider Isoformen gegenüber den Effektoren (z.B. Raf-RBD) stört. Titrationsexperimente haben eine kooperative Bindung an zwei verschiedenen Seiten mit einem Hill-Koeffizienten von 2 und einer Dissoziationskonstanten von 9.9 mM für beide Isoformen ergeben.
Die Inhibition von onkogenem KRasG12D durch 15 verschiedene kleine Substanzen wurde weiter untersucht und es konnte mit Hilfe der 31P-NMR-Spektroskopie gezeigt werden, dass mindestens zwei dieser Komponenten (#755 und #757) zu einer signifikanten Stabilisierung des Zustands 1(T), mit einer Verkleinerung der Gleichgewichtskonstanten von mehr als 70%, führen. Mittels ITC Messungen konnte eine 75%ige Abnahme der Affinität des Ras- Raf Komplexes in der Anwesenheit von 300 μM der entsprechenden Komponente bestimmt werden. Die Experimente zeigten, dass die Komponenten, die ursprünglich für die Inhibition des GDP-gebundenen Ras entwickelt wurden, auch Ras in seiner Triphosphat-gebundenen Form inhibieren können und dementsprechend optimale Kandidaten für eine weitere Optimierung wären.
Das isolierte GppNHp Molekül sowie verschiedene Ras Proteine wurden mittels Hochdruck 31P-NMR-Spektroskopie untersucht. In allen Fällen konnte eine nicht lineare Abhängigkeit der chemischen Verschiebung anhand der positiven Werte des Druckkoeffizienten zweiter Ordnung (B2) gezeigt werden. Für RasWT konnte eine direkte Verschiebung des koformationellen Gleichgewichts von Zustand 2(T) zu Zustand 1(T) anhand der Abnahme der Gleichgewichtskonstanten von 1.7 bei 0.1 MPa zu 0.24 bei 250 MPa beobachtet werden. Außerdem wurden zwei zusätzliche Übergänge detektiert, die Zustand 3(T) und 1(0) benannt wurden. Dabei handelt es sich um den GAP-bindenden Zustand und um den Nukleotid freien Zustand.
Der Zustand 3(T) wurde mittels Titrationsexperiment und 31P-NMR-Spektroskopie identifiziert, bei dem NF1 zu Ras titriert wurde und die Resonanzlinie bei d= -3.00 ppm dem Spektrum von RasWT•Mg2+•GppNHp zugeordnet wurde. Bei equimolarer Konzentration wurde eine Sättigung für das g-Phosphat, aber nicht für das b-Phosphat, erzielt. Diese Tatsache unterstützt die Existenz der konformationellen Unterschiede in der lokalen Umgebung dieser Phosphat Gruppe bei der Bildung des Proteinkomplexes.
Mit Hilfe von ortsspezifischer Mutagenese und der 31P-NMR-Spektroskopie konnte nachgewiesen werden, dass einige Punktmutationen (H27E, S39L, E3V und D33K) zu einer starken Modifikation des konformationellen Gleichgewichts führen. Der stärkste Effekt wurde bei RasD33K•Mg2+•GppNHp beobachtet. Hier erfolgt eine nahezu komplette Verschiebung hin zu Zustand 2(T), wie anhand der Zunahme der Gleichgewichtskonstanten von 1.7 zu 11.3 zu erkennen ist. Die Mutation befindet sich an der Effektor-Schleifen Region von Ras, die in die Interaktion mit verschiedenen Proteinen involviert ist. Eine 30-fache Abnahme der Affinität zu Raf-RBD (KD= 10.4 μM) im Vergleich mit RasWT (KD= 0.42 μM) und eine gestörte Affinität zu NF1 konnte beobachtet werden. Die Zunahme der Gleichgewichtskonstanten von 1.7 zu 2.0 von RasE3V stellt ein gutes Beispiel einer typischen konformationellen Änderung durch einen allosterischen Mechanismus dar, da sich die Mutation auf der entfernten Seite des Nukleotid Bindungszentrums befindet.
Die Kristallstrukturen von RasWT und RasD33K wurden erstmals unter Hochdruck ermittelt. Die Analyse der Kompressibilität der Einheitszelle zeigte die Existenz einer Übergangszone für RasWT zwischen 200 und 270 MPa. Durch die Abnahme der Hauptketten Temperatur Faktoren von 20 Å2 bei 0.1 MPa zu 13.5 Å2 bei 650 MPa, zusammen mit der Zunahme der Durchschnittwerte von rmsd, konnte ein Einblick in die mögliche Stabilisierung von nicht nativen Konformationen bei Hochdruck erhalten werden. Auf der anderen Seite ist RasD33K weniger sensitiv zu Druck und besitzt seine Übergangszone bei etwa 500 MPa und signifikante Änderungen treten ab 880 MPa auf. Typische Druck induzierte Modifikationen involvieren die Helix a2 als Teil des Switch 2, die Schleife λ7 und die Helix a1 am Anfang des Switch 1.
Metadaten zuletzt geändert: 25 Nov 2020 20:11
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