Selectivity enhancement in capillary electrophoresis – development of a two-dimensional separation and a dual detection system - University of Regensburg Publication Server

URN to cite this document:: urn:nbn:de:bvb:355-epub-376243
DOI to cite this document:: 10.5283/epub.37624

Beutner, Andrea

License: Publishing license for publications excluding print on demand
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Date of publication of this fulltext: 08 Jun 2020 08:04

Details

Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Date:	8 June 2020
Referee:	Prof. Dr. Frank-Michael Matysik
Date of exam:	24 July 2018
Institutions:	Chemistry and Pharmacy > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik Chemistry and Pharmacy > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik > Instrumentelle Analytik (Prof. Frank-Michael Matysik)
Keywords:	dual detection; two-dimensional separation; capillary electrophoresis; mass spectrometry;
Dewey Decimal Classification:	500 Science > 540 Chemistry & allied sciences
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	37624

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Abstract (English)

Abstract (English)

For the analysis of complex samples such as biological or environmental ones, highly selective analytical strategies are required. The selectivity can be enhanced by means of hyphenation of orthogonal separation techniques or combination of complementary detectors as an alternative concept. In this work, an example for both concepts is presented, respectively. First, methodical and instrumental studies concerning the comprehensive hyphenation of the two most important instrumental techniques in ion analysis namely ion chromatography (IC) and capillary electrophoresis (CE) are described enabling the simultaneous determination of anions and cations. Further, the combination of capacitively coupled conductless conductivity detection (C4D) and mass spectrometry (MS) as dual detection concept for CE is introduced and applied using aqueous and non-aqueous background electrolyte systems. Another concept to enhance the selectivity is rendering the separation technique compatible to a highly selective detector such as MS. Thus, in a third part, an approach is presented enabling the coupling of surfactant-free microemulsion electrokinetic chromatography (SF-MEEKC) to MS.
For the comprehensive hyphenation of capillary IC and CE, a modulator was developed ensuring well-controlled injections from the first to the second dimension. This was achieved by periodical injection of the IC effluent from a transfer capillary to the CE separation capillary by capillary batch injection. Important for the coupling was the compatibility of the two systems. Thus, the characteristics of the advanced capillary high performance IC with flow rates in the lower µL/min range facilitated the hyphenation being closer to CE conditions compared to IC with conventional columns. Due to the implemented capillary scale suppressor technology, the IC effluent consisted of analyte and pure water avoiding matrix concerned interferences and enabling exploitation of analyte stacking in CE. Further, fast CE measurements in the time range of seconds enabled the comprehensive coupling. Proof-of-concept measurements were performed using a model system containing nucleotides and their cyclic derivates. It was shown that the separation performance could be enhanced in the two-dimensional ICxCE-MS system compared to the single techniques.
The work was further expanded to a methodical study concerning the simultaneous determination of positively and negatively charged analytes. A bypass system for IC was developed using a switching valve. This configuration enabled the cations bypassing the suppressor and thus they were not filtered out by the cation exchange membrane of the suppressor being not selective to eluent cations. Feasibility of the setup was demonstrated separating a model mixture of different arsenic species. The cations were eluted with water from the anion exchange column before driving a KOH gradient elution for the separation of anions. The injection parameters of the modulator introducing the IC effluent into the CE-MS system were studied taking into account the complex transport situation. It was found that the migration times were stable even for highly frequent injections with waiting times between the injections that were a factor four shorter than the migration time itself. Signal intensity of the MS was highest for positively charged species caused by the discriminating effect of the electrokinetic injection and the better ionization of the organic arsenic species by the electrospray ionization (ESI) source.
Further, the coupling of two important detectors for CE is presented, namely capacitively coupled contactless conductivity detection (C4D) and electrospray ionization time-of-flight MS (ESI-TOF-MS). An experimental protocol was developed taking into account the requirements of the separation aspects and the compatibility with both detectors. ESI-TOF-MS requires background electrolytes consisting of volatile components such as ammonium acetate or formate. These, however, exhibit a rather high conductivity, which is disadvantageous for C4D. A 10 mM ammonium acetate/ammonia buffer was taken as compromise concerning the detection performance of both detectors. A sample containing various phenolic compounds serving as a model system was determined. The analytical characteristics showed the complementarity and suitability of this dual detection approach as C4D showed better response behavior towards m-cresol (limit of detection (LOD)=3.1 µM), while MS was more sensitive for determinations of m- and p-nitrophenol (LODs=0.8 µM) and 2,4-dinitrophenol (LOD=1.5 µM). The overall separation efficiency was excellent realizing the separation of counter-electroosmotic species with migration times of less than 60 s and illustrating that detector-induced band broadening could be neglected in the CE-C4D/MS system.
In a second study, non-aqueous electrolytes were used for CE separations as they are highly compatible with both detectors due to their volatility and low background conductivity. A non-aqueous capillary electrophoresis (NACE)-C4D-MS method was developed using an acetonitrile based background electrolyte containing 2 M HAc and 4 mM NH4Ac enabling fast electrophoretic separations. Concentration changes of the background electrolyte and the choice of the inner diameter (ID) of the separation capillary were more critical for C4D than for MS. To choose a separation capillary with appropriate ID, the dependency of the sensitivity of the C4D on the ID was studied resulting in the use of a capillary with ID of 50 µm. The complementarity of the two detectors was demonstrated determining inorganic anions such as chloride, bromide, and nitrate (C4D) as well as organic biomolecules such as choline, thiamine, and acetylcholine (MS) simultaneously. A calibration was performed and the method applied on an extract of a food supplement quantifying the model analytes using the respective detector.
MEEKC is a powerful tool for the separation of neutral species based on differences in their hydrophobic and hydrophilic properties. However, conventionally used SDS-based microemulsions are not compatible with ESI-MS. Enhancing the selectivity of the overall method, a surfactant-free microemulsion (SFME) based on water, ethanol, and 1-octanol was used as background electrolyte ensuring compatibility with ESI-TOF-MS. The small-angle X-ray scattering and dynamic light scattering measurements proved that the addition of ammonium acetate, which was necessary for the electrophoretic separation, was not altering aggregate formation in the SFME in the chosen concentration range. The separation performance of SF-MEEKC was demonstrated separating a model system consisting of hydrophobic and hydrophilic neutral vitamins, namely the vitamins B2 and D3, and the cationic vitamin B1 using UV/VIS detection. The influence of the ammonium acetate concentration on the separation performance was studied in detail. Characterization of the developed method was performed concerning reproducibility of migration times and peak areas and concerning the linearity of the calibration data. Further, the compatibility of SF-MEEKC with ESI-MS was shown determining the content of vitamin D3 in a commercial drug. Comparable sensitivity to aqueous CE-ESI-MS was achieved.

Translation of the abstract (German)

Für die Analyse komplexer Probengemische wie biologische Proben oder Umweltproben sind hochselektive Analysestrategien erforderlich. Die Selektivität kann durch Kopplung zu orthogonalen Trenntechniken oder alternativ durch Kombination komplementärer Detektoren gesteigert werden. In vorliegender Arbeit wird je ein Beispiel für beide Konzepte vorgestellt. Zunächst werden methodische und instrumentelle Untersuchungen zur komprehensiven Kopplung der beiden wichtigsten instrumentellen Trenntechniken der Ionenanalytik, der Kapillarelektrophorese (CE) und der Ionenchromatographie (IC), beschrieben, die die gleichzeitige Bestimmung von Anionen und Kationen ermöglichen. Des Weiteren, wird die Kombination von kapazitiv gekoppelter kontaktloser Leitfähigkeitsdetektion (C4D) und Massenspektrometrie (MS) als duales Detektionskonzept für die CE eingeführt und unter Verwendung von wässrigen und nicht-wässrigen Hintergrundelektrolytsystemen angewendet. Ferner kann die Selektivität gesteigert werden, indem die Kompatibilität einer Trenntechnik zum MS hergestellt wird. So wird in einem dritten Teil die Kopplung der tensidfreien elektrokinetischen Chromatographie mittels Mikroemulsion (SF-MEEKC) zum MS vorgestellt.
Zur komprehensiven Kopplung von Kapillar-IC und CE wurde ein Modulator entwickelt, der kontrollierte Injektionen von der ersten in die zweite Dimension gewährleistete. Dies wurde durch periodische Injektion des von der IC stammenden Ausflusses mittels einer Transferkapillare in die CE Trennkapillare durch Kapillar-Batch-Injektion erreicht. Wichtig für die Kopplung war hierbei die Kompatibilität der beiden Systeme. Die Eigenschaften der fortschrittlichen kapillaren Hochleistungsionenchromatographie wie zum Beispiel die geringen Flussraten im unteren µL/min-Bereich erleichterten die Kopplung, da somit die Flussbedingungen näher an denen der CE lagen verglichen mit den Flussbedingungen der konventionellen Ionenchromatographie. Aufgrund des implementierten Kapillarsuppressors setzte sich der Ausfluss der IC aus Analyt und reinem Wasser zusammen, wodurch Matrixeffekte verhindert wurden und auch „stacking“ Effekte in der CE ausgenutzt werden konnten. Des Weiteren ermöglichten schnelle CE Trennungen mit Migrationszeiten im Sekundenbereich die komprehensive Kopplung. Anhand von „Proof-of-concept“-Messungen mithilfe eines Modellsystems bestehend aus Nukleotiden und deren zyklischen Derivaten wurde gezeigt, dass die Trennleistung durch das zweidimensionale ICxCE-MS-System im Vergleich zu Einzelmessungen gesteigert werden konnte.
Die Arbeit wurde um eine methodische Studie zur simultanen Bestimmung von positiv und negativ geladenen Analyten erweitert. Für die IC wurde ein Bypass-System mit Schaltventil entwickelt. Diese Konfiguration ermöglichte, dass die Kationen den Suppressor umgingen und somit nicht von der Kationen-Austauschmembran des Suppressors herausgefiltert wurden. Diese war nämlich nicht selektiv für die Kationen des Eluenten. Die Funktion des Aufbaus wurde demonstriert, indem ein Modellgemisch verschiedener Arsenspezies getrennt wurde. Die Kationen wurden mit Wasser von der Anionenaustauschsäule eluiert, bevor eine KOH-Gradientenelution zur Trennung der Anionen durchgeführt wurde. Die Injektionsparameter des Modulators, der den Ausfluss der IC in das CE-MS-System einführte, wurden unter Berücksichtigung der komplexen Transportsituation untersucht. Es zeigte sich, dass die Migrationszeiten selbst bei hochfrequenten Injektionen mit Wartezeiten zwischen den Injektionen stabil waren, die um den Faktor vier kürzer waren als die Migrationszeit selbst. Die Signalintensität des MS war am höchsten für positiv geladene Spezies, verursacht durch den diskriminierenden Effekt der elektrokinetischen Injektion und die bessere Ionisierung der organischen Arsenspezies durch die Elektronensprayionisations (ESI)-Quelle.
Des Weiteren wird die Kopplung von zwei wichtigen Detektoren für die CE vorgestellt, nämlich der kapazitiv gekoppelten kontaktlosen Leitfähigkeitsdetektion (C4D) und der Elektrospray-Ionisations-Flugzeit-MS (ESI-TOF-MS). Ein experimentelles Protokoll, das die Anforderungen von Trennaspekten und die Kompatibilität mit beiden Detektoren berücksichtigt, wurde entwickelt. ESI-TOF-MS benötigt Hintergrundelektrolyte, die aus flüchtigen Komponenten wie Ammoniumacetat oder -formiat bestehen. Diese zeigen jedoch eine ziemlich hohe Leitfähigkeit, was für die C4D nachteilig ist. Als Kompromiss bezüglich der Leistung beider Detektoren wurde ein 10 mM Ammoniumacetat/ Ammoniak-Puffer verwendet. Eine Probe, die verschiedene Phenol-Verbindungen enthält, wurde als Modelsystem verwendet und die darin enthaltenen Analyte analysiert. Die analytischen Charakteristika bewiesen die Komplementarität und Eignung dieses dualen Detektionskonzeptes, da die C4D ein besseres Ansprechverhalten für m-Kresol zeigte (Nachweisgrenze (LOD)=3.1 μM), während die MS für Bestimmungen von m- und p-Nitrophenol (LODs=0.8 μM) und 2,4-Dinitrophenol (LOD=1,5 μM) empfindlicher war. Die gesamte Trenneffizienz war hervorragend, da die Trennung von Spezies, die gegen den elektroosmotischen Fluss wanderten, mit Migrationszeiten von weniger als 60 s realisiert wurde und gezeigt wurde, dass detektorinduzierte Bandenverbreiterung im CE-C4D/MS-System vernachlässigt werden konnte.
In einer zweiten Studie wurden nicht-wässrige Elektrolyte für die CE-Trennungen verwendet, da sie aufgrund ihrer Flüchtigkeit und niedrigen Hintergrundleitfähigkeit mit beiden Detektoren sehr kompatibel sind. Eine Methode für die nicht-wässrige Kapillarelektrophorese (NACE) gekoppelt mit dualer C4D-MS-Detektion wurde unter Verwendung eines auf Acetonitril basierenden Hintergrundelektrolyten, der 2 M HAc und 4 mM NH4Ac enthielt, entwickelt, wodurch schnelle elektrophoretische Trennungen ermöglicht wurden. Konzentrationsänderungen des Hintergrundelektrolyten und die Wahl des Innendurchmessers der Trennkapillare waren für die C4D kritischer als für die MS. Um eine Trennkapillare mit geeignetem Innendurchmesser zu wählen, wurde die Abhängigkeit der Empfindlichkeit der C4D vom Innendurchmesser untersucht. Dies führte als Ergebnis zur Verwendung einer Kapillare mit einem Innendurchmesser von 50 µm. Die Komplementarität der beiden Detektoren wurde demonstriert, indem gleichzeitig anorganische Anionen wie Chlorid, Bromid und Nitrat (C4D) sowie organische Biomoleküle wie Cholin, Thiamin und Acetylcholin (MS) bestimmt wurden. Eine Kalibrierung wurde durchgeführt und als Anwendung ein Extrakt eines Nahrungsergänzungsmittels analysiert, wobei die Modellanalyten unter Verwendung des jeweiligen Detektors quantifiziert wurden.
MEEKC ist ein leistungsfähiges Verfahren um neutrale Spezies basierend auf Unterschieden in deren hydrophoben und hydrophilen Eigenschaften zu trennen. Konventionell verwendete SDS-basierte Mikroemulsionen sind jedoch nicht mit ESI-MS kompatibel. Um die Selektivität des Verfahrens zu verbessern, wurde eine tensidfreie Mikroemulsion (SFME) auf Basis von Wasser, Ethanol und 1-Octanol als Hintergrundelektrolyt verwendet, da diese die Kompatibilität mit der ESI-TOF-MS gewährleistete. Die Messungen von Röntgenkleinwinkelstreuung und dynamischer Lichtstreuung zeigten, dass die Zugabe von Ammoniumacetat, das für die elektrophoretische Trennung notwendig war, im gewählten Konzentrationsbereich die Aggregatbildung in den SFME nicht veränderte. Zur Demonstration der Trennleistung der SF-MEEKC-Methode wurde ein Modellsystem bestehend aus hydrophoben und hydrophilen neutralen Vitaminen, nämlich der Vitamine B2 und D3, und des kationischen Vitamins B1 aufgetrennt, wobei UV/VIS-Detektion verwendet wurde. Der Einfluss der Ammoniumacetatkonzentration auf die Trennleistung wurde im Detail untersucht. Das entwickelte Verfahren wurde hinsichtlich der Reproduzierbarkeit von Migrationszeiten und Peakflächen und hinsichtlich der Linearität der Kalibrationsdaten charakterisiert. Ferner wurde die Kompatibilität von SF-MEEKC mit ESI-MS gezeigt, indem der Gehalt an Vitamin D3 in einem kommerziellen Arzneimittel bestimmt wurde. Die erreichte Empfindlichkeit war hierbei vergleichbar mit der aus wässrigen CE-ESI-MS-Bestimmungen.

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