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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-376877
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.37687
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 1 April 2019 |
| Referee: | Prof. Dr. Christine Ziegler |
| Date of exam: | 27 August 2018 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Christine Ziegler |
| Keywords: | Mechanosensitive channels, Archaea, Cryo-EM single particle analysis |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 37687 |
Abstract (English)
Mechanosensitive (MS) channels are found throughout all domains of life since maintaining the intracellular homeostasis is crucial for all living cells. Bacterial MS channels represent the best-characterized force-sensing system. They mainly act as “emergency relief valves” by directly sensing elevated membrane tension as a consequence of osmotic down-shock. Upon opening, the channels release ...
Abstract (English)
Mechanosensitive (MS) channels are found throughout all domains of life since maintaining the intracellular homeostasis is crucial for all living cells. Bacterial MS channels represent the best-characterized force-sensing system. They mainly act as “emergency relief valves” by directly sensing elevated membrane tension as a consequence of osmotic down-shock. Upon opening, the channels release osmotically active solutes and ions from the cell and therefore prevent cell lysis.
In this thesis, two putative archaeal MscS-like channels from N. equitans - Neq198 and Neq531 - were investigated with respect to their structure and function. Major bottlenecks for the analysis of membrane proteins are the expression, solubilization, and purification that should yield sufficient amount of biologically active protein. Both channels were heterologously expressed in E. coli and successfully purified. Here, the N-terminal localization of the tag for purification turned out to be crucial. For Neq198 an optimized purification protocol was established. However, Neq531 is challenging to purify and the purification protocol still requires further optimization.
Membrane-mimicking systems such as lipid nanodiscs and amphipols are highly favored for the analysis of membrane proteins since they provide more native-like environments compared to detergents. Both MscS-like channels were reconstituted into amphipols or lipid nanodiscs for electron microscopy single particle analysis. Single particle analysis of negative-stained channels already gave a rough idea about the channel organization. The resulting 3D volume can be compared to EcMscS, whose structure was solved in 2002 by X-ray crystallography. Here, lipid nanodiscs were highly favored over amphipol for the structural analysis of Neq198. In amphipol reconstituted channels provided less detail than in lipid nanodisc reconstituted channels.
Neq198 reconstituted into lipid nanodiscs was further analyzed in cryo-EM single particle that led to the first putative structure of an archaeal mechanosensitive channel at intermediate resolution so far. The heptameric channel organization was confirmed. While the cytoplasmic domain of the channel is hardly changed compared to EcMscS, the membrane domain exhibits major differences. Two additional helices are located on top of the membrane domain building up a cap-like structure of unknown function. Whether this structural feature takes actively part in tension sensing and e.g. provides interaction with the S-layer of N. equitans is open for speculation. The electrostatic potential surfaces indicate that the channel from N. equitans exhibits higher anion selectivity than its homologue in E. coli (EcMscS).
The functional analyses by patch clamping highlighted that these channels are highly dependent on their native environment. A proper characterization with respect to conductance, activation threshold and ion selectivity failed in liposomes and E. coli spheroplasts. So far, channels reconstituted into liposomes exhibited spontaneous and constitutive activity, although no pressure was applied. These difficulties were mainly contributed to the lipid environment, which is clearly different in N. equitans. To characterize the channels, native lipids from N. equitans are required for future reconstitution and patch clamp analysis. However, hypoosmotic down-shock assays indicate that the channels are purified in active form and do not lose their functionality upon purification.
This thesis provides first structural insights into a MscS-like channel from N. equitans representing the first structure of an archaeal mechanosensitive channel from the MscS family. To increase the resolution of the membrane domain and cap-like structure and to refine the proposed model, more single particle analysis cryo-EM data is required.
Translation of the abstract (German)
Mechanosensitive Känale finden sich in allen Domänen des Lebens, da die Aufrechterhaltung der intrazellulären Homeostase essentiell für alle Zellen ist. Hierbei gelten bakterielle mechanosensitive Kanäle als das bisher am besten untersuchte "force-sensing" System. Als sogenannte “Notfallventile” reagieren diese unmittelbar auf eine erhöhte Membranspannung, welche durch einen hypoosmotischen ...
Translation of the abstract (German)
Mechanosensitive Känale finden sich in allen Domänen des Lebens, da die Aufrechterhaltung der intrazellulären Homeostase essentiell für alle Zellen ist. Hierbei gelten bakterielle mechanosensitive Kanäle als das bisher am besten untersuchte "force-sensing" System. Als sogenannte “Notfallventile” reagieren diese unmittelbar auf eine erhöhte Membranspannung, welche durch einen hypoosmotischen Schock verursacht wird. Durch Öffnen der Kanäle werden kompatible Solute und Ionen aus der Zellen transportiert und verhindern somit eine Zelllyse.
In dieser Arbeit wurden zwei potentielle mechanosensitive Kanäle (MscS) aus N. equitans - Neq198 und Neq531 - hinsichtlich ihrer Struktur und Funktion untersucht. Bei der Untersuchung von Membranproteinen sind vor allem die Expression, Solubilisierung und Reinigung kritische Punkte, um in ausreichender Menge biologisch aktives Protein zu erhalten. Beide Kanäle wurden heterolog in E. coli exprimiert und erfolgreich isoliert.
Im Gegensatz zu Detergenzien stellen Systeme wie Nanodiscs oder Amphipole eine Membran-ähnliche Umgebung zur Verfügung, sodass diese für die Untersuchung von Membranproteinen sehr beliebt sind. Beide Kanäle wurden in Amphipol bzw. Nanodiscs rekonstituiert und mittels Einzelteilchenanalyse im Elektronenmikroskop untersucht. Hierbei lieferten negativ-kontrastierte Kanäle bereits erste Hinweise hinsichtlich der Kanalstruktur und können mit MscS aus E. coli verglichen werden, dessen Struktur bereits 2002 mittels Röntgenkristallographie gelöst wurde. Da die in Amphipol rekonstituierten Kanäle weitaus weniger Details als in Nanodiscs zeigten, wurden Nanodiscs für die weitere Strukturanalyse von Neq198 bevorzugt.
Neq198 rekonstituiert in Nanodiscs wurde intensiver mittels Einzelteilchenanalyse in Kryo-EM untersucht und lieferte die bisher erste Struktur für einen archaeellen mechanosensitiven Kanal bei mittlerer Auflösung. Die siebenfach Symmetrie des Kanals konnte bestätigt werden. Während die cytoplamatische Domäne nahezu unverändert zu EcMscS ist, wurden gravierende strukturelle Veränderungen in der Membrandomäne beobachtet. Hierbei formen zusätzliche Helices oberhalb der Membrandomäne eine Kappen-ähnliche Struktur von bisher unbekannter Funktion. Ob dieses strukturelle Element aktiv im "tension-sensing" Mechanismus teilnimmt oder z. B. eine Interaktion mit dem S-layer von N. equitans vermittelt, ist offen für Diskussionen. Das elektrostatische Oberflächenpotential deutet darauf hin, dass der Kanal aus N. equitans im Vergleich zum homologen Kanal in E. coli (EcMscS) eine höhere Anionenselektivität aufweist.
Die funktionelle Analyse mittels Patch-Clamp zeigte, dass beide Kanäle in höchstem Maße von der native Lipidumgebung aus N. equitans abhängig sind. Eine ausführliche Charakterisierung hinsichtlich der Leitfähigkeit, Druckschwellenwert und Ionenselektivität in Liposomen und E. coli Spheroplasten war nicht möglich. Kanäle rekonstituiert in Liposomen zeigten eine spontane Aktivität, obwohl kein Druck ausgeübt wurde. Dennoch deutet ein hypoosmotischer "Downschock-Assay" darauf hin, dass beide Kanäle in aktiver Form gereinigt wurden und diese ihre Funktionalität nicht verlieren.
Diese Doktorarbeit gibt erste strukturelle Eindrücke zu einem MscS-ähnlichen Kanal aus N. equitans und stellt damit die erste Struktur eines archaeellen mechanosensitiven Kanals aus der MscS Familie dar. Um die Auflösung zu verbessern und das vorgeschlagene Strukturmodel zu verfeinern, werden weitere Kryo-EM Daten zur Einzelteilchenanalyse benötigt.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 19:14
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