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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-378360
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Date: | 9 October 2019 |
| Referee: | PD Dr. Markus Kretz |
| Date of exam: | 8 October 2018 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Lehrstuhl für Biochemie I |
| Keywords: | Skin, lncRNA, non-coding RNA, Epidermis |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 37836 |
Abstract (English)
Constituting an effective barrier against environmental challenges such as pathogen invasion, UV-radiation or prevention of extensive water loss, the epidermis as the outermost layer of the human skin has to be constantly regenerated in order to maintain its protective function. During this highly elaborate and delicate process of epidermal rejuvenation, progenitor keratinocytes conduct a ...
Abstract (English)
Constituting an effective barrier against environmental challenges such as pathogen invasion, UV-radiation or prevention of extensive water loss, the epidermis as the outermost layer of the human skin has to be constantly regenerated in order to maintain its protective function. During this highly elaborate and delicate process of epidermal rejuvenation, progenitor keratinocytes conduct a terminal differentiation program which is accompanied by fluctuating expression of differentiation proteins and ultimately results in tightly agglutinated, dead and flattened cells that are embedded in an extracellular lipid layer.
In light of these profound alterations in gene expression, it is not surprising that epidermal homeostasis is controlled by an extensive network of signaling pathways, transcription factors and more recently also the involvement of long non-coding RNAs (lncRNAs) for this vital process has been uncovered. One of these regulatory lncRNAs might be the 326 nt spanning transcript SPRR5_326, which was initially identified from full transcriptome sequencing as a lncRNA that is induced over the course of keratinocyte differentiation and at the same time suppressed in squamous cell carcinoma samples. According to this particular expression pattern, a dual role of SPRR5_326 for both these processes seemed promising and the impact of sustained SPRR5_326 expression on skin carcinogenesis was tested by an in vitro invasion assay and an in vivo tumor formation assay with inconclusive results. Surprisingly, a subsequent in depth isoform characterization for the novel SPRR5 locus revealed that the assumed SPRR5_326 transcript was not final but part of a longer (726 nt) SPRR5 transcript that is controlled by the transcription factor p63 and seems to be primarily localized in the cytoplasm of differentiated keratinocytes.
In contrast to the results from the conducted tumor formation assays, an indispensable functional impact of SPRR5 for keratinocyte differentiation could be established for in vitro differentiated keratinocytes as well as in regenerated organotypic epidermal tissue. Additionally, a global RNA-sequencing experiment ultimately proved the necessity of SPRR5 for a proper terminal differentiation program and hinted towards an epigenetic mechanism. Therefore, an Assay for Transposase Accessible Chromatin (ATAC-Seq) as well as a Chromatin Immunoprecipitation (ChIP-Seq) experiment for the histone marks H3K27me3, H3K4me1 and H3K27ac was conducted in SPRR5 deficient and control keratinocytes, however the results from these experiments could not support this initial assumption.
Interestingly, the SPRR5 transcript also encloses an open reading frame for a putative SPRR5 protein, which shares a high degree of similarity to the human small proline-rich protein (SPRR) family. On the other hand, a subsequent phylogenetic analysis uncovered the separate evolution of SPRR5 apart from the other SPRRs and thus suggests a different mode of action for SPRR5. Based on these observations, the actual presence of the predicted SPRR5 protein was investigated and only minor protein amounts could be detected with a highly targeted and sensitive mass spectrometry approach, raising the question whether SPRR5 functions as a protein, a lncRNA or a combination of both. Eventually this enigma should be solved by rescue experiments, though unfortunately the siRNA-mediated SPRR5 depletion lead to inconclusive results and also the generation of a homozygous SPRR5 knockout cell line was unsuccessful, precluding a final statement about the functional SPRR5 molecule in keratinocytes.
In conclusion an in-depth characterization of the human SPRR5 locus, including the detection as well as the functional testing of minor SPRR5 protein amounts has been conducted and the hypothesized necessity of SPRR5 for epidermal homeostasis could be ultimately confirmed during this work.
Translation of the abstract (German)
Als effektive Barriere gegen Umwelteinflüsse wie UV-Strahlung, Vermeidung eines starken Wasserverlustes oder Pathogeninvasion muss die Epidermis als äußerste Schicht der menschlichen Haut konstant regeneriert werden, um ihre schützende Funktion aufrecht erhalten zu können. Im Laufe dieses hochkomplexen und minutiös gesteuerten Prozesses der epidermalen Verjüngung durchlaufen Vorläufer ...
Translation of the abstract (German)
Als effektive Barriere gegen Umwelteinflüsse wie UV-Strahlung, Vermeidung eines starken Wasserverlustes oder Pathogeninvasion muss die Epidermis als äußerste Schicht der menschlichen Haut konstant regeneriert werden, um ihre schützende Funktion aufrecht erhalten zu können. Im Laufe dieses hochkomplexen und minutiös gesteuerten Prozesses der epidermalen Verjüngung durchlaufen Vorläufer Keratinozyten ein terminales Differenzierungsprogramm, welches mit drastischen Veränderung der Expression von Differenzierungsproteinen einhergeht und dessen Resultat schließlich stark agglutinierte, tote und abgeflachte Zellen sind, die in einer extrazellulärer Lipidschicht eingebettet sind.
Angesichts dieser tiefgreifenden Veränderungen in der Genexpression ist es nicht verwunderlich, dass die epidermale Homöostase durch ein äußerst komplexes Netzwerk von Signaltransduktionswegen, Transkriptionsfaktoren und wie kürzlich gezeigt wurde auch durch lange nicht kodierende RNAs (lncRNAs) gesteuert wird. Eine dieser regulatorischen lncRNAs könnte das 326 nt umfassende Transkript SPRR5_326 sein, das ursprünglich in einer Transkriptomanalyse als eine lncRNA identifiziert wurde, welche im Verlauf der Keratinozytendifferenzierung induziert und gleichzeitig in Plattenepithelkarzinomproben reprimiert wird. Gemäß diesem besonderen Expressionsmuster scheint SPRR5_326 eine Schlüsselrolle bei beiden Prozessen einzunehmen, weshalb zunächst der Einfluss einer forcierten SPRR5_326-Expression auf die Hautkrebsentstehung mittels eines in vitro Invasionsexperimentes und einem in vivo Tumorentwicklungsexperiment getestet wurde, was allerdings nur zu uneindeutigen Ergebnissen führte. Überraschenderweise ergab eine anschließende detaillierte Isoformcharakterisierung für den bisher unbekannten SPRR5-Locus, dass das angenommene SPRR5_326-Transkript nicht komplett war, sondern Teil eines längeren (726 nt) SPRR5-Transkripts ist, welches durch den Transkriptionsfaktor p63 kontrolliert wird und vorzugsweise im Cytoplasma von differenzierten Keratinozyten lokalisiert zu sein scheint. Im Gegensatz zu den Ergebnissen der Tumorentwicklungsstudien konnte eine wichtige funktionelle Bedeutung von SPRR5 für die Keratinozytendifferenzierung sowohl für in vitro differenzierte Keratinozyten als auch für organotypisches epidermales Gewebe nachgewiesen werden. Eine anschließende Analyse des globalen Expressionsmuster bestätigte schließlich die Notwendigkeit von SPRR5 für den korrekten Abaluf des terminalen Differenzierungsprogrammes und deutete auf einen epigenetischen Mechanismus von SPRR5 hin. Daher wurde ein Assay für Transposase-zugängliches Chromatin (ATAC-Seq) sowie ein Chromatin-Immunpräzipitations-Experiment (ChIP-Seq) für die Histonmodifikationen H3K27me3, H3K4me1 und H3K27ac in SPRR5-defizienten und Kontroll-Keratinozyten durchgeführt, allerdings konnten die Ergebnisse aus diesen Experimenten die anfängliche Hypothese nicht weiter unterstützen.
Interessanterweise befindet sich im SPRR5-Transkript auch ein offener Leserahmen für ein hypothetisches SPRR5-Protein, welches eine große Ähnlichkeit zur humanen small proline rich protein (SPRR) Familie aufweist. Eine anschließende phylogenetische Analyse zeigte jedoch die separate Entwicklung von SPRR5 weg von den anderen SPRRs und impliziert daher eine andere Wirkungsweise für SPRR5. Basierend auf diesen Beobachtungen wurde zunächst das tatsächliche Vorkommen des vorhergesagten SPRR5-Proteins untersucht und nur geringe Proteinmengen konnten mit einem sehr zielgerichteten und empfindlichen Massenspektrometrie-Ansatz nachgewiesen werden, was die Frage aufwirft, ob SPRR5 als ein Protein, eine lncRNA oder eine Kombination aus beiden funktioniert. Letztendlich sollte dieses Rätsel durch Rescue-Experimente gelöst werden, die aber unglücklicherweise zu unklaren Ergebnissen führten und auch die Erzeugung einer homozygoten SPRR5-Knockout-Zelllinie blieb erfolglos, was eine abschließende Aussage über das funktionelle SPRR5-Molekül in Keratinozyten unmöglich machte.
Zusammenfassend wurde eine detaillierte Annotation des bisher nicht charakterisierten humanen SPRR5-Locus, einschließlich des Nachweises sowie der funktionellen Testung von kleinen SPRR5-Proteinmengen durchgeführt und die vermutete Notwendigkeit von SPRR5 für die epidermale Homöostase konnte während dieser final Arbeit belegt werden.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 15:43
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