| License: Publishing license for publications excluding print on demand (7MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-378600
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.37860
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 1 April 2019 |
| Referee: | Prof. Dr. Ralf Wagner |
| Date of exam: | 15 October 2018 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene |
| Keywords: | CMV, T cells, viral vectors, immune monitoring |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 500 Natural sciences & mathematics 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 37860 |
Abstract (English)
Human Cytomegalovirus (CMV) is a highly prevalent β-herpesvirus that establishes life-long latency after primary infection. Congenital CMV infection is the most common viral compli-cation in newborns, causing a number of late sequelae that range from impaired hearing to mental retardation. At the same time, managing CMV reactivation during immunosup-pression remains a major hurdle in ...
Abstract (English)
Human Cytomegalovirus (CMV) is a highly prevalent β-herpesvirus that establishes life-long latency after primary infection. Congenital CMV infection is the most common viral compli-cation in newborns, causing a number of late sequelae that range from impaired hearing to mental retardation. At the same time, managing CMV reactivation during immunosup-pression remains a major hurdle in post-transplant care.
Since CMV-specific T cells are critical for controlling viral reactivation, monitoring of T cell responses is a promising strategy to identify patients at risk for symptomatic CMV disease. T cell responses are mostly quantified after antigen-specific restimulation, which requires presentation of pathogen-derived peptides by antigen-presenting cells (APCs). Here, it was tested if protein carbamoylation, a posttranslational modification of amino groups occur-ring in vivo during renal dysfunction or inflammation, impacts the uptake of recombinant proteins into APCs and, as a result, also T cell restimulation. The CMV proteins immediate-early 1 (IE 1) and pp65, which are the main targets of T cell-mediated immunity during CMV infection, as well as the Epstein-Barr virus (EBV) protein BZLF1 were chosen as model proteins and recombinantly produced for addressing this question. As a result of protein carbamoylation, antigen-specific restimulation of T cells was increased for pp65 (mean in-crease 39%, ranging from 6-112% for different blood donors) and BZLF1 (mean increase 80%, ranging from 5-161%), but decreased for IE 1. Mass spectrometry analysis revealed that lysine residues were almost completely modified (>90%), while arginine car-bamoylation was negligible under the chosen conditions (0.3%). The removal of positive charges from amino groups as a result of carbamoylation was found to be important for the enhanced restimulation of pp65-specific T cells, since this effect could be reverted by addition of the polyanionic competitor fucoidan. In addition, protein maleylation, another posttranslational modification removing positive charges from amino groups, mediated a similar increase in the restimulation of pp65-specific T cells. T cell responses to car-bamoylated pp65 were increased compared to the unmodified protein, irrespective of whether monocytes, macrophages or dendritic cells acted as APCs. Improved restimulation of pp65-specific T cells was shown to be the result of enhanced protein uptake into APCs, which increased both MHC I and MHC II presentation.
In summary, protein charges appear to have a major influence on uptake into antigen-presenting cells, which could be harnessed for improving current methods for T cell im-munomonitoring and the design of novel vaccines.
In the second part of this thesis, new viral vectors delivering the T cell immunogens IE 1 and pp65 were evaluated with regard to suitability as future CMV vaccine candidates. The vectors were based on Adenovirus 19a/64 (Ad19a/64) or Sendai virus (SeV) and compared side-by-side to the well-established vector platforms Ad5 and Modified Vaccinia Ankara (MVA). All vectors were characterized virologically and immunologically in a series of ex vivo assays with a focus on dendritic cells (DCs), which are the main population priming T cell responses in vivo.
It was found that unlike Ad5, Ad19a/64 vectors readily transduce a broad panel of im-mune cells, including monocytes, T cells, NK cells and monocyte-derived dendritic cells (moDCs). Both Ad19a/64- and MVA-transduced moDCs efficiently restimulated IE 1 or pp65-specific T cells, but MVA induced a higher amount of cytotoxicity in this cell type. Ad5 and Ad19 induced upregulation of the maturation markers CD86 and HLA-DR in moDCs whereas expression of CD80 and CD83 was largely unaltered. By contrast, MVA transduction led to downregulation of all markers.
To enhance the safety of SeV vectors, a replication-deficient strain (rdSeV) that infects tar-get cells in a non-productive manner while retaining viral gene expression was used in this thesis. rdSeV was compared to the parental, replication-competent Sendai virus strain (rcSeV) as well as MVA. rcSeV was capable of replicating to high titers in DCs while rdSeV infected cells abortively. Due to the higher degree of attenuation, IE 1 and pp65 protein levels mediated by rdSeV after infection of DCs were markedly reduced compared to the parental rcSeV strains, but antigen-specific restimulation of T cell clones was not negatively affected by this. Importantly, rdSeV showed reduced cytotoxic effects compared to rcSeV and MVA and was capable of mediating DC maturation as well as secretion of Interferon α and Interleukin 6.
Taken together, these data demonstrate that both rdSeV and Ad19a/64 have great po-tential as novel vector systems for the delivery of CMV immunogens.
Translation of the abstract (German)
Das humane Zytomegalievirus (CMV) weist weltweit hohe Seroprävalenz auf und etabliert nach der Primärinfektion lebenslange Latenz. Infektionen mit CMV sind die häufigste virale Komplikation bei Neugeborenen und verursachen eine Reihe von Spätfolgen wie Schwer-hörigkeit oder geistige Behinderungen. Zusätzlich stellen CMV Reaktivierungen die bedeu-tendste pathogen-assoziierte Komplikation bei ...
Translation of the abstract (German)
Das humane Zytomegalievirus (CMV) weist weltweit hohe Seroprävalenz auf und etabliert nach der Primärinfektion lebenslange Latenz. Infektionen mit CMV sind die häufigste virale Komplikation bei Neugeborenen und verursachen eine Reihe von Spätfolgen wie Schwer-hörigkeit oder geistige Behinderungen. Zusätzlich stellen CMV Reaktivierungen die bedeu-tendste pathogen-assoziierte Komplikation bei Transplantatempfängern dar.
Da T Zellen eine entscheidende Rolle bei der Kontrolle viraler Reaktivierungen einnehmen, stellt die Überwachung CMV-spezifischer T Zell Antworten eine vielversprechende Strategie zur frühzeitigen Identifikation von Patienten mit erhöhtem Risiko für symptomatische CMV Erkrankung dar. Derzeit werden pathogen-spezifische T Zellen hauptsächlich infolge von Restimulation mit entsprechenden Antigenen nachgewiesen und quantifiziert, was deren Prozessierung und Präsentation durch Antigen-Präsentierenden Zellen (APCs) voraussetzt. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob Carbamoylierung (eine posttranslationale Modifikati-on die auch in vivo im Zuge von Niereninsuffizienz oder Entzündungen vorkommt) die Aufnahme rekombinanter Proteine in APCs und damit die Restimulation von T Zellen be-einflusst. Hierfür wurden die CMV Proteine Immediate-early 1 (IE 1) und pp65, welche während CMV Infektionen die stärksten T Zell Antworten hervorrufen, sowie das Epstein-Barr virus (EBV) Protein BZLF1 rekombinant hergestellt. Carbamoylierung verbesserte die Restimulation pp65-spezifischer T Zellen im Durchschnitt um 39%, (6-112%, je nach indi-viduellem Blutspender) und BZLF1-spezifischer T Zellen um 80% (5-161%), wohingegen die IE 1 Antworten stark verringert waren. Massenspektrometrische Analysen zeigten, dass unter den gewählten Reaktionsbedingungen Lysine quantitativ modifiziert wurden (>90%), wohingegen Arginin-Carbamoylierung kaum nachzuweisen war (0.3%). Es zeigte sich außerdem, dass das Entfernen positiver Ladungen infolge der Carbamoylierung not-wendig für die verbesserte T Zell Restimulation ist, da sich der Effekt durch Zugabe des polyanionischen Kompetitors Fucoidan aufheben ließ. Zudem hatte Maleylierung, eine weitere posttranslationale Modifikation, welche das Entfernen positiver Ladungen von Aminogruppen zur Folge hat, einen ähnlichen Einfluss auf die Restimulierung pp65-spezifischer T Zellen. Die Verbesserung der T Zell Stimulation durch carbamoyliertes pp65 war unabhängig davon ob Monozyten, Makrophagen oder dendritische Zellen als APCs fungierten. Der Grund hierfür scheint eine generell erhöhte Aufnahme in Antigen-präsentierende Zellen zu sein, wobei sowohl MHC-I, als auch MHC-II Präsentation verbes-sert waren.
Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass die Ladung von Proteinen die Aufnahme in APCs stark beeinflusst, was beispielsweise in die Verbesserung aktueller T Zell Diagnostika oder die Herstellung neuartiger Impfstoffe einfließen könnte.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden neuartige virale Vektoren für die Verabreichung der T Zell Immunogene IE 1 und pp65 hinsichtlich ihrer Eignung als CMV Impfstoffkandidaten evaluiert. Die Vektoren basieren auf dem Adenovirus Subtyp 19a/64 (Ad19a/64), sowie Sendai Virus (SeV) und wurden direkt mit den etablierten Vektoren Adenovirus Subtyp 5 (Ad5) und Modified Vaccinia Ankara (MVA) verglichen. Alle Vektoren wurden in einer Reihe von ex vivo Studien hinsichtlich verschiedener virologischer und immunologischer Parameter charakterisiert. Hierbei lag ein besonderer Fokus auf dendritischen Zellen (DCs), da diese in vivo hauptsächlich für das Priming naiver T Zellen verantwortlich sind.
Hierbei zeigte sich, dass Ad19a/64 Vektoren im Gegensatz zu Ad5 in der Lage sind, ein breites Panel an Immunzellen, bestehend aus Monozyten, T Zellen, NK Zellen und mono-cyte-derived dendritic cells (moDCs), zu transduzieren. Sowohl Ad19a/64, als auch MVA waren in der Lage, moDCs effizient zu transduzieren und die Restimulation IE 1- und pp65-spezifischer T Zell Klone zu vermitteln. Allerdings induzierte MVA in einem deutlich stärkeren Ausmaß als Ad19a/64 Zytotoxizität in DCs. Infolge der Transduktion mit Ad5 und Ad19a/64 wurden die Maturationsmarker CD86 und HLA-DR hochreguliert, wobei das Expressionsniveau der Marker CD80 und CD83 unverändert blieb. Im Gegensatz dazu wurde die Expression aller Maturationsmarker infolge der Transduktion mit MVA herabre-guliert.
Um die Sicherheit SeV-basierter Vektoren zu erhöhen, wurde in dieser Arbeit ein replikati-onsdefizienter Virusstamm (rdSeV) eingesetzt, der die Expression viraler Gene in Zielzellen induziert, wobei die Bildung neuer Viruspartikel unterbleibt. rdSeV wurde sowohl mit dem parentalen, replikationskompetenten SeV Stamm (rcSeV), als auch mit MVA verglichen. Es zeigte sich, dass rcSeV effizient in humanen DCs repliziert, wohingegen Infektion mit rdSeV abortiv abläuft. Mit dem erhöhten Grad an Attenuierung von rdSeV ging, verglichen mit rcSeV, zugleich ein vermindertes Expressionsniveau von IE 1 und pp65 einher, jedoch war die Restimulation antigenspezifischer T Zellen hiervon nicht negativ beeinflusst. Es ist zu-dem hervorzuheben, dass rdSeV auch geringere Zytotoxizität im Vergleich mit rcSeV und MVA aufwies und die Maturation von DCs, sowie die Sezernierung von Interferon α und Interleukin 6 induzierte.
Insgesamt zeigen diese Daten, dass sowohl rdSeV, als auch Ad19a/64 vielversprechende neue Vektorsysteme für die Verabreichung von CMV Immunogenen darstellen.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 19:04
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