| License: Creative Commons Attribution 4.0 (5MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-381723
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 16 December 2019 |
| Referee: | Prof. Dr. Wolfgang Herr |
| Date of exam: | 13 December 2018 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Innere Medizin III (Hämatologie und Internistische Onkologie) |
| Keywords: | Isocitrat Dehydrogenase, D-2-hydroxygluterate, Dendritische Zelle, Metabolismus, Differenzierung, Immuntherapie |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 500 Natural sciences & mathematics 500 Science > 570 Life sciences 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 38172 |
Abstract (English)
1 Generation of IDH2 R140Q specific T cells In the last decades, immunotherapy has become an important part of cancer treatment. For a cancer-specific immunotherapy, it is essential to find a target structure which is restricted to cancer cells but is not expressed on other cells. This is possible with “tumor-specific” antigens. In the first part of the project the goal was to create a T cell ...
Abstract (English)
1 Generation of IDH2 R140Q specific T cells
In the last decades, immunotherapy has become an important part of cancer treatment. For a cancer-specific immunotherapy, it is essential to find a target structure which is restricted to cancer cells but is not expressed on other cells. This is possible with “tumor-specific” antigens. In the first part of the project the goal was to create a T cell population expressing a T cell receptor specifically recognizing the mutated IDH2 R140Q enzyme. T cells were either stimulated with antigen presenting cells (APCs) loaded with a IDH2 R140Q protein specific peptide or with APCs transfected with the IDH2 R140Q protein. Suitable peptides were estimated by online tools (BIMAS, SYFPETHI and NET MHC Pan). The most promising binding properties were found for the HLA-B*15:01 restricted 9mer IQNILGGTV (IQN9) having the mutated amino acid at the second position (anchor position). Although we successfully generated IQN9-peptide specific T cells, it was not possible to find a T cell population specifically recognizing APCs expressing the IDH2 R140Q protein upon transfection. This could be explained by the fact that the mutated aminoacid was on an anchor position and not in the T cell receptor binding region. T cells stimulated with IQN9-peptide loaded APCs recognized a neuramidase protein (expressed by influenza A viruses) derived peptide which showed a similar amino acid sequence, in addition to the IQN9-peptide. Apparently, neuramidase-specific T cells were re-stimulated by the IDH2 R140Q derived peptide, a phenomenon known as molecular mimicry.
2 Effect of D-2-HG on metabolism and differentiation of monocyte-derived dendritic cells
In the second part of the project the impact of the onco-metabolite D-2-Hydroxyglutarate (D 2 HG), produced by the mutated IDH, on myeloid cells was analyzed. D-2-HG is known to be released by different tumor entities as leukemia or glioma harbouring IDH mutations. The impact of D-2-HG on the differentiation of monocytes into DCs and on DC metabolism was examined. Monocytes are able to take up D-2-HG. Besides increased cell sizes, D-2-HG treated DCs had less and shorter dendrites than control cells after 7 days of culture. Cell yield and viability remained unaffected by D-2-HG treatment. CD1a, a differentiation marker was not expressed in D-2-HG treated DCs. DC-SIGN, HLA-DR and –DP, required for T cell priming and activation, were also significantly less expressed on D-2-HG treated DCs. Furthermore, D-2-HG treatment changed the cytokine profile of mature DCs. The pro-inflammatory cytokine IL-12 was significantly less secreted in the presence of D-2-HG. To analyze the functional consequences of the D-2-HG induced DC phenotype on T cell stimulation, we performed allogenic mixed lymphocyte reactions with CD4 T cells. D-2-HG treated DCs were characterized by a reduced stimulatory capacity, indicated by a reduced IFN production and diminished proliferation of CD4 T cells.
In a next step, the metabolic profile of DCs was analyzed in the presence of D-2-HG. Respiration analyses revealed higher oxygen consumptions in D-2-HG treated DCs as well as in DCs expressing mutated IDH1 or IDH2 enzyme. Moreover, glycolytic activity analyzed by glucose consumption and lactate secretion was increased, in line with the earlier pH drop measured by the PreSens technology. The higher respiratory and glycolytic activity resulted in increased ATP levels. Furthermore, cytosolic reactive oxygen species (ROS) levels were significantly increased in the presence of D 2 HG. Since respiration displays an important source of ROS, we hypothesized that, antioxidants like vitamin C might reduce the increased ROS levels and thereby also the inhibitory effect of D-2-HG on DC differentiation. Vitamin C had a positive effect on HLA-DP expression, but only a minor effect on HLA-DR expression. DC-SIGN expression reached control levels in vitamin C and D-2-HG treated DCs.
In another series of experiments, anti-diabetic drugs modulating the metabolism were applied with the aim to rescue inhibitory D-2-HG effects on DC differentiation, as metformin (an inhibitor of complex I of the electron transport chain) and pioglitazone (a ligand for peroxisome proliferator-activated receptor ). In contrast to metformin, pioglitazone treatment partially neutralized the effects induced by D-2-HG.
As D 2 HG is a known modulator of DNA methylation, DCs were analyzed by MassARRAY in the presence of D 2 HG and vitamin C. Vitamin C acts as a co factor for TET2, an important demethylase in DC differentiation. We hypothesized that vitamin C could rescue marker expression on an epigenetic level. As expected, D 2 HG delayed the demethylation of sites, which are known to be important for DC differentiation. A single treatment with vitamin C did speed up the demethylation process. Vitamin C was able to partly compensate for the inhibitory effect of D-2-HG on demethylation in some regions, but levels of untreated DCs were not reached.
Finally, primary AML blasts with IDH mutations were analyzed, regarding their HLA class expression. In line with the results obtained for D-2-HG treated monocyte-derived DCs, HLA class II expression was also decreased in primary IDH mutated AML blasts.
Taken together, our results indicate that D-2-HG inhibits the differentiation of monocyte to DCs, which can have in turn an impact on T cell stimulation. Thereby D-2-HG is indirectly able to reduce the immunological anti-tumor response. D-2-HG can promote immune escape by reducing HLA class II expression in an autocrine and paracrine way. Moreover, D-2-HG diminishes the stimulatory capacity of DCs and decreases the immunogenicity of AML blasts.
Translation of the abstract (German)
1 Generierung von IDH2 R140Q spezifischer T Zellen In den letzten Jahrzenten ist die Immuntherapie ein wichtiger Bestandteil in der Behandlung von Krebsleiden geworden. Für eine Krebs-spezifische Immuntherapie ist es essentiell, eine geeignete zelluläre Zielstruktur zu finden, die ausschließlich von Tumorzellen, jedoch nicht von anderen Zellen exprimiert wird. Dies ist mit tumor-spezifischen ...
Translation of the abstract (German)
1 Generierung von IDH2 R140Q spezifischer T Zellen
In den letzten Jahrzenten ist die Immuntherapie ein wichtiger Bestandteil in der Behandlung von Krebsleiden geworden. Für eine Krebs-spezifische Immuntherapie ist es essentiell, eine geeignete zelluläre Zielstruktur zu finden, die ausschließlich von Tumorzellen, jedoch nicht von anderen Zellen exprimiert wird. Dies ist mit tumor-spezifischen Antigenen möglich. Ein Ziel im ersten Teil dieses Projekts war die Generation von T Lymphozyten, die spezifisch die mutierte Isozitrat Dehydrogenase (IDH) 2 (R140Q) erkennen. T Zellen wurden mit Antigen präsentierenden Zellen (APCs) stimuliert, die entweder mit dem IDH2 R140Q Peptid beladenen wurden oder mit dem IDH2 R140Q mRNA transfiziert wurden. Geeignete Peptide wurden mittels Online-Vorhersageprogrammen (BIMAS, SYFPETHI und NET MHC Pan) ermittelt. Die erfolgversprechendsten HLA-Molekül-Bindungseigenschaften hatte das HLA-B*15:01 restringierte 9mer IQNILGGTV (IQN9), bei dem die Aminosäure an der zweiten Stelle mutiert ist (Ankerposition). Obwohl wir erfolgreich IDH2 R140Q Peptid spezifische T Zellen generierten, war es nicht realisierbar eine T Zell Population zu generieren, die das IDH2 R140Q Protein auf transfizierten APCs erkennt. Grund hierfür war vermutlich, dass die mutierte Aminosäure an eine Ankerposition und nicht in der Region in der der T Zellrezeptor bindet lag. T Zellen, die mit IQN9-Peptid beladenen APCs stimuliert wurden, erkannten zusätzlich zum IQN9-Peptid ein Neuramidase Protein (exprimiert von Influenza A Viren). Scheinbar wurden Neuramidase spezifische T Zellen durch das von der IDH2 R140Q abstammende Peptid re stimuliert, ein Phänomen, das als molekulares Mimikry bekannt ist.
2 Effekt von D-2-HG auf den Metabolismus und die Differenzierung von aus Monozyten gereiften dendritischen Zellen
Im zweiten Teil des Projekts wurde der Effekt des Onko-Metabolits D-2-Hydroxyglutarat (D-2-HG), das von der mutierten IDH produziert wird, auf myeloide Zellen untersucht. D-2 HG wird von verschiedenen Tumoren, wie Leukämien oder Gliomen, die eine mutierte IDH aufweisen, abgegeben. Der Effekt von D-2-HG auf die Differenzierung von Monozyten zu dendritischen Zellen (DZs) und auf den Metabolismus von DZs wurde untersucht. Monozyten sind in der Lage D-2-HG aufzunehmen. Nach 7 Tagen wiesen D-2-HG behandelte DZs sowohl einen signifikant größeren Zelldurchmesser als auch weniger und kürzere Dendriten als unbehandelte Kontrollzellen auf. Die Zellausbeute und die Viabilität blieben durch die Behandlung mit D-2-HG unverändert. CD1a, ein Differenzierungsmarker, wurde in mit D-2-HG behandelten DZs nicht mehr exprimiert. Die Expression der Marker DC SIGN, HLA-DR und –DP, welche wichtig für das T Zell Priming und die Aktivierung sind, war in D-2-HG behandelten DZs signifikant niedriger. Des Weiteren veränderte die Behandlung mit D-2-HG das Zytokin-Profil der ausgereiften DZs. Das pro-inflammatorische Zytokin IL-12 wurde in Gegenwart von D 2 HG signifikant weniger ausgeschüttet. Um die funktionellen Konsequenzen des durch die D-2-HG Behandlung induziert Phänotyps zu analysieren, wurde eine allogene Gemischte-Lymphozyten-Reaktion mit CD4 T Zellen durchgeführt. Mit D-2-HG behandelte DZs waren durch eine verminderte Stimulationsfähigkeit gekennzeichnet, wobei die IFNγ Produktion und die Proliferation von CD4 Zellen erniedrigt war.
In einem weiteren Schritt wurde das metabolische Profil von DZs in der Gegenwart von D-2-HG analysiert. Die Analyse der Respiration zeigte einen erhöhten Sauerstoffverbrauch sowohl in D-2-HG behandelten DZs, als auch in IDH1 und IDH2 mutierten DZs. Außerdem war die glykolytische Aktivität, gemessen durch Glukoseabnahme und Laktatsekretion, erhöht, was mit dem verfrühten Abfall des pH-Wertes einherging, welcher mit Hilfe der PreSens Technologie bestimmt wurde. Die erhöhte glykolytische und respiratorische Aktivität führte zu höheren ATP Spiegeln. Zudem waren zytosolische reaktive Sauerstoff Spezies (ROS) Level in Anwesenheit von D-2-HG signifikant erhöht. Da eine erhöhte Atmungsaktivität eine wichtige Quelle für ROS darstellen kann, stellten wir die Hypothese auf, das Antioxidationsmittel wie Vitamin C erhöhte ROS Level verringern und hierdurch auch der inhibitorische Effekt von D-2-HG auf die Differenzierung von DZs reduziert werden könnte. Vitamin C erhöhte die HLA-DP Expression, hatte jedoch nur einen geringen Effekt auf die HLA-DR Expression. Die DC-SIGN Expression auf Vitamin C und D-2-HG behandelten DZs erreichte ein Level das mit dem der Kontrolle vergleichbare war.
In weiteren Experimenten, wurden anti-diabetische Substanzen verwendet, die den Metabolismus modifizieren, wie Metformin (ein Inhibitor des Komplex I der Atmungskette) und Pioglitazon (ein Ligand für den Peroxisom Proliferator-aktivierten Rezeptor ), um den inhibitorischen D 2 HG Effekt auf die DZ Differenzierung auszugleichen. Im Gegensatz zu Metformin, war die Pioglitazon Behandlung in der Lage sowohl die Atmung als auch die HLA-DR Expression von D-2-HG behandelten DZs auf den Level unbehandelten DZs auszugleichen.
Da D-2-HG einen bekannten Modulator der DNA Methylierung darstellt, wurden DZs, die mit D 2 HG und Vitamin C behandelt wurden, mit Hilfe von MassARRAY analysiert. Vitamin C ist ein Ko-Faktor für TET2, einer wichtigen Demethylase während der DZ Differenzierung. Deshalb vermuteten wir, dass Vitamin C die Expression bestimmter Marker auf epigenetischer Ebene wiederherstellen kann. Wie zu erwarten, verzögerte D 2 HG die Demethylierung von Gen Bereichen, die bekannter Weise wichtig für die DZ Differenzierung sind. Eine Behandlung mit Vitamin C allein führte zu einer Beschleunigung des Demethylierungsprozesses. In Anwesenheit von D-2-HG, führte Vitamin C nur in geringem Maße zu höheren Demethyliereundsanteil, wobei vergleichbare Level zu unbehandelten DZs nicht erreicht werden konnten.
Zuletzt wurde die HLA Klasse II Expression in primären AML Blasten, die eine IDH Mutation aufweisen, untersucht. Vergleichbar zu den Ergebnissen, die mit D-2-HG behandelten DZs gewonnen wurden, war die HLA Klasse II Expression in primären, IDH mutierten AML Blasten ebenfalls erniedrigt.
Zusammenfassend, zeigen unsere Daten, dass D-2-HG die Differenzierung von DZs aus Monozyten hemmte. Durch die vermindert HLA Klasse II Expression verringert D-2-HG die stimulatorische Kapazität von DZs und Immunogenität von AML Blasten. So kann D 2 HG indirekt die immunologische anti-tumorale Antwort auf autokrinem und parakrinem Weise vermindern und so zur Immunevasion führen.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 15:43
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