Zusammenfassung (Deutsch)
Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Etablierung von ELISpot-Testverfahren zum Nachweis einzelner Interferon-γ-sezernierender T-Zellen mit Spezifität für Adenoviren, HSV-1 und VZV für eine erweiterte Immundiagnostik. Mittels geeigneter Zellkultursysteme konnten die als Testantigen erforderlichen Viren (10 Serotypen der Adenoviren, HSV-1 und VZV) in ausreichenden Mengen angezüchtet und mit ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Etablierung von ELISpot-Testverfahren zum Nachweis einzelner Interferon-γ-sezernierender T-Zellen mit Spezifität für Adenoviren, HSV-1 und VZV für eine erweiterte Immundiagnostik. Mittels geeigneter Zellkultursysteme konnten die als Testantigen erforderlichen Viren (10 Serotypen der Adenoviren, HSV-1 und VZV) in ausreichenden Mengen angezüchtet und mit verschiedenen Verfahren wie Focus Forming Assays (FFA), Plaquenachweisverfahren oder PCR quantifiziert werden.
In der durchgeführten Studie wurden 19 Probanden zweimal im Abstand von 6 Wochen im ELISpot auf die verschiedenen Serotypen des Adenovirus, die rekombinanten Hexonproteine, das HSV-1 und das VZV getestet. Durch Entnahme von PBMC aus den erhaltenen Blutproben wurde somit die T-Zellantwort gemessen. Im Falle der Adenoviren konnte ein INF-γ-ELISpot etabliert werden, der für die häufig vorkommenden Serotypen der Spezies B und C deutlich höhere Prozentzahlen spezifisch reaktiver T-Zellen zeigte, als die der weniger frequenten Serotypen wie AdV12 oder -34. Im Vergleich der Hexonproteine erzielte das Hexon 5 im Median eine stärkere Signalhöhe als das Hexon 2 und ist somit ebenfalls geeignet, um eine Adenovirusspezifische T-Zellantwort zu detektieren. Das HSV-1 löste bei einem großen Teil der Probanden sehr hohe Zahlen an SFC aus, jedoch ist die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse mit 7 diskrepanten Ergebnissen zwischen den beiden Blutentnahmezeitpunkten bei den 19 Probanden relativ gering.
Das VZV zeigte im ELISpot, verglichen mit den anderen Viren, insgesamt sehr niedrige Spotzahlen. Dennoch lagen bei 84,3% Prozent der Probanden an beiden Entnahmezeitpunkten übereinstimmend positive Ergebnisse vor, während bei 3 Studienteilnehmern diskrepante Resultate auftraten. Der Vergleich der Ergebnisse im ELISpot mit der im ELISA gemessenen Serologie zeigte bei Adenoviren deutliche Unterschiede. Am geringsten fiel dieser im Falle des ELISA der Firma Euroimmun aus, welcher auch den weitesten Grenzbereich aufweist. Während 77,9 % der Ergebnisse im ELISpot als positiv gewertet wurden, waren es im Falle dieses ELISA-Assays 84,3 %. Am größten war der Unterschied beim Serion ELISA für Erwachsene. Hier wurden nur 5,2 % der Probanden als positiv gewertet, während nahezu 90% ein negatives Ergebnis erzielten. Im Serion ELISA für Kinder wurden 15,8 % positiv gewertet und knapp 80 % als negativ. Im Falle des HSV-1 fiel der Unterschied zwischen Serologie und T-Zellantwort kleiner aus. Den 12 positiv getesteten Probanden im ELISpot standen 11 im ELISA gegenüber. Während 7 Ergebnisse im ELISpot nicht eindeutig waren, wurden im ELISA 7 Probanden als negativ gewertet, während nur eines als nicht auswertbar befunden wurde. Im ELISpot des VZV wurden 84,3 % der Probanden als positiv und 15,7 % diskrepant gewertet, im ELISA erreichten hingegen 100 % der Probanden ein positives Ergebnis. Insgesamt konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass der ELISpot bei gesunden Probanden eine zuverlässige Aussage über den spezifischen T-Zellstatus bezüglich Adenoviren, HSV-1 und VZV geben kann. Daher ist es im weiteren Verlauf von Interesse, diese Ergebnisse auf eine Patientenstudie auszuweiten. Geplant ist die Anwendung des Testverfahrens an BAL-Proben intubierter Patienten, bei welchen der Verdacht einer HSV-1 assoziierten Pneumonie besteht, um die T-Zellantwort zu ermitteln (s.1.5.). Hierüber soll untersucht werden, ob der T-Zellstatus als Surrogatmarker für die Reaktivierungswahrscheinlichkeit des Virus dienen kann. Ebenso soll der ELISpot bei Immunsupprimierten, insbesondere Stammzelltransplantierten in einer Studie verwendet werden. Des Weiteren besteht die Möglichkeit, mit Hilfe des ELISpots das Zytokinprofil der virusspezifischen T-Zellen intensiver zu erforschen. So können über den Einsatz verschiedener Primärantikörper unterschiedliche, durch T-Zellen sezernierte Zytokine detektiert werden und somit genauere Aussagen über die virusspezifische T-Zellantwort getroffen werden.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
The objective of this thesis has been the development of an ELISpot-assay for the detection of virus-specific, interferon-γ secreting t-cells. 10 serotypes of the adenovirus, HSV-1 and VZV were cultured in suitable cell culture systems and quantified by PCR. For the study PBMC were obtained from 19 probands. PBMC were tested in an ELISpot-assay with reference to their virus-specific t-cell ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
The objective of this thesis has been the development of an ELISpot-assay for the detection of virus-specific, interferon-γ secreting t-cells. 10 serotypes of the adenovirus, HSV-1 and VZV were cultured in suitable cell culture systems and quantified by PCR. For the study PBMC were obtained from 19 probands. PBMC were tested in an ELISpot-assay with reference to their virus-specific t-cell response using the cultured viruses and recombinant hexon proteins of the adenovirus as antigens. To verify the reproducibility of the results the assay was performed twice with an interval of 6 weeks. In a last step results of the ELISpot-assay, representing the cellular immune system were compared to a serological assay using an ELISA. An ELISpot-assay with detection of interferon-γ secreting t-cells could be successfully developed for all three viruses.
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