| License: Creative Commons Attribution 4.0 (24MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-402570
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.40257
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 4 June 2020 |
| Referee: | Prof. Dr. Michael Rehli |
| Date of exam: | 28 May 2019 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie |
| Keywords: | Macrophages, Collagen, Hofbauer Cells, EGR2 |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 40257 |
Abstract (German)
Makrophagen sind ein essentieller Teil der angeborenen Immunabwehr. Hierbei sind sie verantwortlich für die Erkennung und Phagozytose von Bakterien. Zusätzlich führen Gewebemakrophagen viele homöostatische Funktionen aus, die vom jeweiligen Gewebe abhängen. Dadurch sind sie häufig involviert in der Entstehung und Progression von Krankheiten, wie zum Beispiel in Tumoren, Arthritis, Präeklampsie ...
Abstract (German)
Makrophagen sind ein essentieller Teil der angeborenen Immunabwehr. Hierbei sind sie verantwortlich für die Erkennung und Phagozytose von Bakterien. Zusätzlich führen Gewebemakrophagen viele homöostatische Funktionen aus, die vom jeweiligen Gewebe abhängen. Dadurch sind sie häufig involviert in der Entstehung und Progression von Krankheiten, wie zum Beispiel in Tumoren, Arthritis, Präeklampsie und Asthma. Außerdem können Makrophagen durch die Vielzahl an exprimierten Rezeptoren auf ihrer Oberfläche, kleinste Veränderungen in ihrer Umgebung wahrnehmen und darauf mit einem veränderten Phänotyp reagieren. Eine Untersuchung der möglichen Veränderungen der Zellen könnte helfen, ihren Beitrag zu verschiedenen Krankheiten besser zu verstehen und neue therapeutische Möglichkeiten zu eröffnen.
Dementsprechend wurden in dieser Arbeit Monozyten aus dem periphären Blut von gesunden Spendern in verschiedenen Konditionen zu Makrophagen differenziert. Um die resultierenden Makrophagen eingehend zu studieren wurde ihr Transkriptom mittels RNA Sequenzierung und die offene Chromatinstruktur mit ATAC-seq analysiert. Von allen analysierten Konditionen, hatte Kollagen den gr ̈oßten Einfluss auf die Zellen. Es induzierte Gene, die mit der Komplement Kaskade, Chemotaxis und der Endozytose assoziiert sind, wohingegen es inflammatorische Gene und Gene der Extrazellulären Matrix inhibierte. Um mehr über die Regulatoren, die hinter diesen Unterschieden in der Genexpression stehen, zu erfahren, haben wir das offene Chromatin der Zellen analysiert. Kollagen-spezifische zugängliche Regionen waren angereichert für ETS, ETS:IRF, NFAT und MAF Motive. Da Kollagen-Makrophagen eine signifikant erhöhte Expression von MAF, IRF4, ETS2 und NFATC2 aufwiesen, wurden diese als mögliche Kandidaten weiter analysiert. Mit Hilfe von ChIP-seq Daten für c-MAF und so genannten Footprint Analysen der restlichen Motive, konnten wir leider keinen der Faktoren als Verantwortlichen für die Genexpressionsunterschiede identifizieren. Allerdings k ̈onnten nicht nur induzierte, sondern auch inhibierte Faktoren für die Regulation der Genexpression verantwortlich sein. Zwei Transkriptionsfaktoren, Dec2 und EGR2, k ̈amen dafu ̈r in Frage, da sie in Kollagen-Makrophagen nicht exprimiert wurden. Da die Bindungssequenzen der Faktoren im Standardmakrophagen spezifisch offenen Chromatin angereichert waren, analysierten wir die Bindungseigenschaften der beiden Faktoren mittels ChIP-seq. Dabei konnten wir zeigen, das sie diese Regionen im Chromatin binden und somit in der Regulation von Genen w ̈ahrend der Differenzierung eine Rolle spielen könnten. Um die Auswirkung der reduzierten Expression dieser zuletzt genannten Transkriptionsfaktoren weiter zu untersuchen, wurden Knock-Down Experimente für beide in humanen Monozyten durchgeführt. Reduktion des Dec-2 Levels zeigte lediglich einen geringeren Effekt auf den Phänotyp von Makrophagen, wohingegen der Verlust von EGR2 einen stärkeren Einfluss zeigte. EGR2 knock down Makrophagen wiesen eine ähnliche Morphologie wie Kollagen-Makrophagen auf. Des weiteren zeigten sie ebenfalls reduzierte Expression von Makrophagen spezifischen Genen, zum Beispiel CSF1 und CHI3L1. Daraus lässt sich schließen, dass EGR2 während der Differenzierung notwendig ist um Makrophagen spezifische Gene zu aktivieren. In der Analyse des aktiven Chromatins nach EGR2 knock down fanden wir ebenfalls eine hohe Ähnlichkeit zwischen den mit Kollagen behandelten Makrophagen und den EGR2 Knock Down Zellen. Im Vergleich mit Plastik-Makrophagen zeigten beide eine verringerte Zugänglichkeit in speziellen Chromatin Regionen. Dies deutet darauf hin, dass die Induktion von EGR2, durch die Adhäsion der Zellen auf Plastik, notwendig ist für eine Öffnung des Chromatins und der Expression vieler Makrophagen spezifischer Gene. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde das Transkriptom und die Chromatinlandschaft von CD163 positiv sortierten Hofbauer Zellen analysiert. Mittels RNA Sequenzierung konnten wir zeigen, dass sie eine erhöhte Expression von Wachstumsfaktoren, zum Beispiel VEGFA oder M-CSF, aufweisen. Im Gegensatz dazu inhibieren Hofbauer Zellen Gene, die mit Immunabwehr und der viralen Abwehr zusammenhängen. Interessanterweise exprimierten Kollagen-Makrophagen und Hofbauer Zellen zum Teil ähnliche Gene, diese umfassten unter anderem den Komplement C1q Komplex und CD163, was darauf hinweist das die Interaktion mit Kollagen auch in residenten Gewebemakrophagen eine Rolle spielt. Um Kandidaten für die Regulation der Genexpression zu entdecken, analysierten wir die Motiv Signatur des offenen Chromatins in Hofbauer Zellen, wobei wir eine Anreicherung von ETS, bZIP, MAF und NR4A1 Motiven entdeckten. Da die Transkriptionsfaktoren MAF und NR4A1 in Hofbauer Zellen stark exprimiert waren, k ̈onnten sie verantwortlich sein für die beschriebenen Expressionsmuster. Zusammenfassend konnten wir feststellen, dass Hofbauer Zellen essentiell fu ̈r die korrekte Entwicklung der Plazenta sind. Dabei weisen sie ein anti-inflammatorischen Phänotyp auf, der für die Toleranz der Mutter zum Fötus eine wichtige Rolle spielt. Darüberhinaus exprimieren sie aber auch viele Rezeptoren, welche verantwortlich für die Erkennung von Pathogenen sind. Dies deutet darauf hin, dass diese Makrophagen auch in der Lage sind eine inflammatorische Reaktion einzuleiten. Des weiteren haben wir zwei Transkriptionsfaktoren, MAF und NR4A1, gefunden, die möglicherweise für die Regulation der Genexpression verantwortlich sein könnten.
Translation of the abstract (English)
Macrophages are an essential part of innate immunity, here they are responsible for rec- ognizing pathogens and their elimination, as well as activating cells of the adaptive im- mune system, by antigen presentation. Furthermore, in every tissue there is a resident macrophage population, which performs fundamental homoeostatic functions in addition to host defence. This is why they have been ...
Translation of the abstract (English)
Macrophages are an essential part of innate immunity, here they are responsible for rec- ognizing pathogens and their elimination, as well as activating cells of the adaptive im- mune system, by antigen presentation. Furthermore, in every tissue there is a resident macrophage population, which performs fundamental homoeostatic functions in addition to host defence. This is why they have been implicated in the progression of many dis- eases, including cancer, rheumatoid arthritis, pre-eclampsia and asthma. In addition, these highly plastic cells react with phenotypic switches to minute changes in their environment. Thus a better understanding of the polarization capabilities of human macrophages could further our understanding of their de-regulation in diseases and provide better therapeutic approaches.
In this thesis, we differentiated human monocytes in a variety of conditions to macrophages. In order to gain a global picture of the resulting phenotypes, we analysed their transcrip- tome using RNA-seq and their accessible chromatin landscape with ATAC-seq. From all analysed conditions, collagen-treatment had the strongest effect on macrophage differ- entiation, which was characterized by many gene expression changes. The cells highly expressed genes associated with the complement cascade, endocytosis and chemotaxis, whereas they down-regulated genes involved in the inflammatory response and extracellu- lar matrix organization, including collagens, integrins and matrix-metalloproteinases. In order to shed light on the regulatory mechanisms behind the described gene expression patterns, we analysed the accessible chromatin landscape of collagen-macrophages in com- parison to plastic-macrophages. A de novo motif analysis revealed an enrichment for ETS, ETS:IRF, NFAT and Maf motifs in collagen-macrophages, additionally, the cells highly expressed ETS2, MAF, IRF4 and NFATC2, indicating an involvement of these factors in mediating gene expression changes. Unfortunately, using ATAC footprints over the enriched motifs and ChIP-seq analysis for c-MAF, we could not identify, which transcrip- tion factor could be responsible for mediating collagen-induced gene expression changes. Possibly, a combination of several factors, their rearrangement on the chromatin and their post-transcriptional activation is involved, but this hypothesis needs to be tested further. Not only the up-, but also the down-regulation of transcription factors could provide an explanation for altered gene expression patterns. Since Dec2 and EGR2 were not ex- pressed in collagen-macrophages, we further analysed their binding patterns. Their motifs were enriched in plastic-macrophage specific open chromatin and ChIP-seq data showed an enrichment of EGR2 and Dec2 binding in plastic-macrophage open chromatin regions, further pointing to an involvement of these factors during macrophage differentiation. To clarify their role, we performed siRNA mediated knock down experiments for both fac- tors in monocytes, which were then differentiated on plastic. The removal of Dec2 had only a small impact on macrophage polarization, whereas the knock down of EGR2 led to a loss of gene expression in many genes also repressed by collagen treatment. The open chromatin analyses revealed that collagen-treatment and EGR2 knock down led to reduced chromatin accessibility in the same genomic regions, which were furthermore en- riched for the EGR2 motif. This data indicates, that EGR2 expression during monocyte to macrophage differentiation may be required for chromatin remodelling and successful expression of macrophage specific genes.
In the second part of this work, the transcriptome and accessible chromatin landscape of ex vivo isolated, CD163 sorted Hofbauer cells were analysed. We could show that the cells ex- pressed many growth factors, whereas they down-regulated genes associated with cytokine production and viral processes, thereby, we confirmed the reported anti-inflammatory, tissue-remodelling phenotype of the cells. Furthermore, both Hofbauer cells and collagen- macrophages expressed genes involved in the complement cascade (C1QA, C1QC) and CD163, suggesting that the interaction of tissue macrophages with collagen influences the gene expression patterns of Hofbauer cells in vivo. In order to analyse the regulatory mechanisms behind the gene expression patterns, we analysed the accessible chromatin landscape of the cells. Hofbauer cell specific open chromatin regions, in comparison to in vitro generated macrophages, were enriched for MAF and nuclear receptor NR4A1 motifs. Additionally, Hofbauer cells highly expressed NR4A1, suggesting that this factor could be involved in regulating their gene expression. Interestingly, collagen-treatment also induced MAF and collagen-specific open chromatin regions were enriched for the same MAF motif, indicating that this transcription factor could be regulating commonly expressed genes.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 17:58
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