| License: Publishing license for publications excluding print on demand (6MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-406029
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.40602
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Date: | 14 July 2020 |
| Referee: | Prof. Dr. Dr. Barbara Braunger |
| Date of exam: | 15 July 2019 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Anatomie Biology, Preclinical Medicine > Institut für Anatomie > Lehrstuhl für Humananatomie und Embryologie Biology, Preclinical Medicine > Institut für Anatomie > Lehrstuhl für Humananatomie und Embryologie > Prof. Dr. Ernst Tamm |
| Keywords: | Endothelin, retina, photoreceptors, neuroprotection |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 40602 |
Abstract (German)
Das vasoaktive Peptid Endothelin wird als drei Isoformen (Endothelin 1, 2, 3) exprimiert, die an zwei G-Protein gekoppelte Rezeptoren Endothelin Rezeptor Typ a (Eta) und Endothelin Rezeptor Typ b (Etb) binden können. Die Rolle des Endothelin-Signalwegs im Auge ist noch weitgehendst unbekannt und wird kontrovers diskutiert. Deshalb war es das Hauptziel dieser Arbeit die Rolle des ...
Abstract (German)
Das vasoaktive Peptid Endothelin wird als drei Isoformen (Endothelin 1, 2, 3) exprimiert, die an zwei G-Protein gekoppelte Rezeptoren Endothelin Rezeptor Typ a (Eta) und Endothelin Rezeptor Typ b (Etb) binden können. Die Rolle des Endothelin-Signalwegs im Auge ist noch weitgehendst unbekannt und wird kontrovers diskutiert.
Deshalb war es das Hauptziel dieser Arbeit die Rolle des Endothelin-Signalwegs im Auge zu untersuchen und besonders einem potenziellen neuroprotektiven Effekt von Etb für das Überleben von Photorezeptoren nach Licht-induzierter Schädigung nachzugehen. Außerdem sollten die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen aufgeschlüsselt werden.
Zunächst wurde die Lokalisation des Etb im Auge untersucht und durch immunhistochemische Doppelfärbungen dessen zelltypspezifische Lokalisation bestimmt. Außerdem wurde die retinale Expressionstärke von Etb im Vergleich zu Eta ermittelt. Des Weiteren sollte die Expression des gesamten Endothelin-Signalwegs in wildtypischen Retinae im Falle von okulärem Trauma, hervorgerufen durch alleinige Perforation des Auges, PBS-Injektion oder Lichtschaden, untersucht werden. In allen drei Schadensmodellen kam es zu einer Aktivierung des gesamten Endothelin-Signalwegs.
Anschließend generierten wir mittels Cre-loxP-System eine Mauslinie mit einer Deletion von Etb im gesamten Auge (EtbΔeye) und eine weitere Mauslinie mit einer Etb Deletion in Müllerzellen und retinalen Neuronen (EtbΔOC). Darüber hinaus etablierten wir Photorezeptorzelllinien mit einer stabilen Deletion von Etb mittels des CRISPR/Cas9-System. Die Deletion von Etb in retinalen Neuronen und Müllerzellen führte zu keinen offensichtlichen Veränderungen der retinalen Morphologie und Gefäßstruktur. Allerdings war die Vulnerabilität der Photorezeptoren bei EtbΔOC Mäusen nach Licht-induzierten Photorezeptor Degeneration signifikant höher, einhergehend mit einer signifikant dünner äußeren Körnerschicht 14 Tage nach Lichtschaden. Auch die Etb-defizienten Photorezeptor-Zelllinien wiesen eine signifikant höhere Apoptoserate nach Zellstress, verursacht durch Serum-Entzug, auf. Weiterführende molekulare Analysen zeigten, eine signifikante Erhöhung der neuroprotektiven Faktoren leucaemia inhibitory factor (lif) und fibroblast growth factor (fgf2) bei lichtgeschädigten EtbΔOC Mäusen im Vergleich zu lichtgeschädigten Kontrolltieren. Überraschenderweise detektierten wir dennoch eine signifikante Erhöhung von Caspase 8 bei lichtgeschädigten EtbΔOC Mäusen im Vergleich zu lichtgeschädigten Kontrolltieren, was den Rückschluss nahelegt, dass die beobachtete verstärkte Degeneration der Photorezeptoren durch den extrinsischen, d.h. durch Todesrezeptoren vermittelten Signalweg ablief. Weiterführende Analysen identifizierten eine verminderte Aktivierung (Phosphorylierung) des neuroprotektiven Protein Kinase B (Akt) Signalwegs als den Signalweg worüber Etb sein neuroprotektives Signal vermittelt.
Zusammenfassend zeigen die erhobenen Daten erstmals, dass das durch den Etb vermittelte Signal essenziell und weitaus potenter für das Überleben von Photorezeptoren ist als die Wirkung der neuroprotektiven Faktoren fibroblast growth factor 2 (Fgf2) und leukaemia inhibitory factor. Downstream von Etb wird die Neuroprotektion über den Akt-Signalweg vermittelt.
Zukünftig kann dieser durch Etb vermittelte Signalweg einen vielversprechenden Ansatz für die Entwicklung von neuen Therapieansätzen zur Behandlung retinaler Degenerationen wie Retinopathia pigmentosa oder altersbedingte Makuladegeneration darstellen.
Translation of the abstract (English)
The three endothelin isoforms (Endothelin 1, 2, 3) signal through two G-protein coupled receptors: Endothelin receptor type a (Eta) and Endothelin receptor type a (Etb). In the eye, the role of Endothelin signalling is discussed controversially. Thus, the main aim of the current thesis was to investigate the role of endothelin signalling in the eye and in particular whether Etb mediates ...
Translation of the abstract (English)
The three endothelin isoforms (Endothelin 1, 2, 3) signal through two G-protein coupled receptors: Endothelin receptor type a (Eta) and Endothelin receptor type a (Etb). In the eye, the role of Endothelin signalling is discussed controversially.
Thus, the main aim of the current thesis was to investigate the role of endothelin signalling in the eye and in particular whether Etb mediates neuroprotective effects for photoreceptor survival following experimentally induced photoreceptor degeneration. Moreover, the underlying molecular mechanisms mediating the potential neuroprotection were examined in detail.
First, the localization of Etb in the eye was analysed and its cell-type specific localization was identified using immunohistochemical co-staining. Furthermore, its quantitative expression in the retina was determined.
Next, we examined an activation of the entire Endothelin signalling in the retinae of wildtype mice in response to different ocular traumata (puncture of the eye, PBS-injections, light-induced damage).
Then, conditional knockout mice with a deletion of Etb in the entire eye (EtbΔeye) and a second mouse line with a cell type specific deletion of Etb in retinal neurons and Müller cells (EtbΔOC) were generated using the Cre-loxP-System. Additionally, photoreceptor cell lines (661WΔEtb) with a stable deletion of Etb were created via CRISPR/Cas9.
The in vivo ablation of Etb in Müller cells and retinal neurons showed no obvious alterations of retinal morphology and vasculature. However, EtbΔOC mice showed a higher vulnerability of photoreceptors after light-induced photoreceptor degeneration concomitant with a significantly thinner outer nuclear layer (ONL). In accordance, our in vitro data obtained a significantly higher apoptosis rate in Etb-deficient photoreceptor cells after serum-deprivation compared to controls. Quite intriguingly, the expression levels of neuroprotective molecules leukaemia inhibitory factor (Lif), and fibroblast growth factor 2 (Fgf2) were significantly elevated in light-exposed EtbΔOC mice compared to light-exposed control littermates. Still we detected a significantly upregulated mRNA expression of Caspase 8 indicating that the increased apoptosis of photoreceptors was mediated via extrinsic death-receptor mediated apoptosis in EtbΔOC mice. Furthermore, we identified an impaired activation (phosphorylation) of the neuroprotective Protein Kinase B (Akt) signalling pathway.
Taken together, our data identified Etb mediated signalling as the essential and even more potent neuroprotective event for photoreceptor survival compared to the neuroprotective factors fibroblast growth factor 2 (Fgf2) and leukaemia inhibitory factor (Lif). Downstream of Etb its neuroprotective signalling is mediated through activation of Akt signalling.
In summary, our data identified Etb mediated signalling for the first time as the essential pathway for photoreceptor survival. Thus, targeting Endothelin signalling might be a promising approach for the development of new therapeutic strategies in the context of retinal degenerations.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 17:44
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