A key requirement to get more insight into the functional role of lipid species is their accurate and precise quantification in biological samples. Considering that, mass spectrometry provides the main analytical tool. The following work describes the development of a flow injection analysis Fourier-Transform mass spectrometry (FIA-FTMS) method to analyze and quantify lipid species profiles of biological samples in high throughput. The method applied a Q Exactive Orbitrap with a maximum resolution of 140,000 at m/z 200, a simple lipid extraction (Bligh and Dyer), short analysis times of less than 4 min and an automated data evaluation with self-programmed macros in Microsoft Excel.
Data deconvolution of lipidomic data includes isotope correction as a crucial step, which comprises the correction of the natural abundance of isotopes (type I effect) and the overlap resulting from the second isotope of a species with one additional double bond (type II effect). Experiments with synthetic standards revealed peak coalescence for a number of lipid species, a phenomenon described for Fourier-Transform mass spectrometry (FTMS) as constructive and/or destructive interference of peaks. Peak coalescence occurs for near-isobaric ions e.g. related to type II overlap in double bond series with m/z 0.00894 (for isotopic peaks resulting from incorporation of two 13C-atoms). Here, we could demonstrate that, despite peak coalescence, accurate quantification is possible for a wide range of lipid species. As expected, peaks with m/z < 600 require no type II correction due to sufficient mass resolution to resolve isobaric peaks within a double bond series. Unexpected, peaks with m/z > 800 did not require type II isotope correction despite completely overlapping isobaric peaks within a double bond series. In the mass range m/z 600-800, accuracy of the concentrations of partially overlapping peaks could be improved by the so-called I/A correction (developed in this thesis). The I/A correction applies a correction factor that is calculated from the intensity and area of the overlapping peaks.
Furthermore, we could show that, upon full scan FTMS quantification, cholesteryl esters (CE) show substantial differences in their analytical response depending on the number of double bonds (DB), length of the acyl chain,
Abstract
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infused lipid concentration, and other lipid components. A major determinant for these response differences is their susceptibility to in-source fragmentation. In particular, introduction of DB lowers the degree of in-source fragmentation. Moreover, the results obtained by synthetic standards allowed the calculation of response factors, whose application corrected for the analytical response differences, as the comparison with a certified enzymatic test confirmed. The determination of free cholesterol (FC) was performed by simultaneous collection and fragmentation of precursor ions of FC and D7-FC (FIA-MSX/FTMS). The quantification matched the results obtained with an established acetyl chloride derivatization method, which improved signal intensities by ~400 fold.
Finally, method validation demonstrated that FIA-FTMS and FIA-MSX/FTMS are applicable for quantification of lipid species in biological samples used in basic science as well as in clinical studies such as cultured cells, tissue homogenates, plasma, and serum. The method showed a high reproducibility and sufficient sensitivity for precise and accurate quantification.

Eine genaue und reproduzierbare Quantifizierung von Lipidspezies ist von entscheidender Bedeutung für ein besseres Verständnis der funktionellen Bedeutung von Lipidspezies. Die Massenspektrometrie stellt dafür das wichtigste analytische Verfahren dar. Die folgende Arbeit beschreibt die Entwicklung einer Fließ-Injektion-Analyse Fourier-Transformation Massenspektrometrie Methode (FIA-FTMS) zur Messung und Quantifizierung von Lipidspeziesprofilen in biologischen Proben mit einem hohen Probendurchsatz. Die Methode wurde an einer Q Exactive Orbitrap mit einer maximalen Auflösung von 140,000 bei m/z 200 entwickelt. Um einen hohen Probendurchsatz zu erreichen wurde eine einfache Aufarbeitung (Bligh & Dyer Extraktion), kurze Messzeiten von weniger als 4 Minuten und eine selbst programmierten Daten Auswertung in Microsoft Excel verwendet.
Ein wichtiger Schritt in der Datenauswertung von lipidomischen Daten stellt die Isotopenkorrektur dar, die zum einen für das natürliche Vorkommen der Isotope (Isotopenkorrektur Typ I) und zum anderen für den Überlapp des zweiten Isotops einer Spezies mit einer zusätzlichen Doppelbindung (Isotopenkorrektur Typ II) korrigiert. Durch Experimente mit synthetischen Standards konnte gezeigt werden, dass eine Reihe von Lipidspezies von Peak Koaleszenz betroffen ist. Dabei handelt es sich um ein Phänomen, welches für Fourier-Transformation Massenspektrometer als konstruktive und/oder destruktive Interferenz von Peaks beschrieben wurde. Peak Koaleszenz kann bei nah-isobaren Ionen auftreten, wie z.B. dem Typ II-Überlapp in Doppelbindungsserien (m/z 0.00894 für einen Überlapp resultierend aus zwei 13C-Atomen). Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass trotz Peak Koaleszenz eine akkurate Quantifizierung von Lipidspezies über einen weiten Bereich möglich ist. Wie erwartet ist für Spezies mit m/z < 600 keine Typ-II Korrektur notwendig, da die Massenauflösung ausreichend für eine Trennung der isobaren Peaks innerhalb einer Doppelbindungsreihe ist. Unerwartet war, dass für Spezies mit m/z > 800 keine Typ-II Korrektur nötig ist, obwohl isobare Spezies hier z.T. vollständig überlappen. Im Massenbereich von m/z 600 bis 800 kommt es zu einem partiellen Überlapp von isobaren Peaks. Hier konnte gezeigt werden, dass mittels „I/A“-Korrektur die Richtigkeit der ermittelten
Zusammenfassung
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Konzentrationen deutlich verbessert wird. Dafür wird ein Korrekturfaktor aus Intensität und Fläche der isobaren Peaks bestimmt und mit der Konzentration multipliziert.
Außerdem konnten wir zeigen, dass Cholesterin Ester (CE) wesentliche Unterschiede in der analytischen Response in Bezug auf Kettenlänge, Zahl der Doppelbindungen, infundierte CE Gesamtkonzentration und das Vorhandensein zusätzlicher Lipidklassen aufweisen. Als Hauptgrund für die Response Unterschiede konnten wir Fragmentierungsprozesse in der Ionenquelle während der Elektronspray-Ionisation nachweisen. Die Fragmentierung in der Ionenquelle nimmt insbesondere mit der Zahl der Doppelbindungen in den CE Spezies ab. Mit Hilfe synthetischer Standards konnten Responsefaktoren zur Korrektur der CE Spezies berechnet werden. Erst durch Anwendung dieser Responsefaktoren konnte eine gute Übereinstimmung von Serum-Konzentration mittels FTMS und einem zertifizierten enzymatischen Test erreicht werden. Die Bestimmung von freiem Cholesterin (FC) erfolgt über die gleichzeitige Sammlung und Fragmentierung der Vorläuferionen von FC und D7-FC (FIA-MSX/FTMS). Die Quantifizierung mit den spezifischen Cholestadiene Fragmenten zeigte im Vergleich mit einer etablierten Acetylchlorid-Derivatisierung übereinstimmende Resultate.
Eine abschließende Methodenvalidierung demonstrierte, dass FIA-FTMS und FIA-MSX/FTMS zur Quantifizierung von Lipidspezies in biologischen Proben wie Plasma, Serum, Geweben oder Zellhomogenaten in wissenschaftlichen und klinischen Studien geeignet sind. Die Methoden überzeugen durch hohe Reproduzierbarkeit und ausreichende Sensitivität.