| License: Publishing license for publications excluding print on demand (2MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-407460
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.40746
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 10 September 2020 |
| Referee: | Prof. Dr. Antje J. Bäumner |
| Date of exam: | 9 September 2019 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik > Chemo- und Biosensorik (Prof. Antje J. Bäumner, formerly Prof. Wolfbeis) |
| Keywords: | liposomes, bioanalysis, surface functionalization |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 40746 |
Abstract (English)
Nanocontainers are being applied for many bioanalytical strategies, e.g. in bioassays, in chemosensors or for bioimaging and in vivo applications. They vary with respect to the materials used (such as mesoporous silica, polymers or proteins). These enable different unique characteristics mainly through their cavities or pores for the entrapment of numerous signaling molecules and their large ...
Abstract (English)
Nanocontainers are being applied for many bioanalytical strategies, e.g. in bioassays, in chemosensors or for bioimaging and in vivo applications. They vary with respect to the materials used (such as mesoporous silica, polymers or proteins). These enable different unique characteristics mainly through their cavities or pores for the entrapment of numerous signaling molecules and their large surface area for the attachment of various surface tags. Of special interest is their signal amplification capability where the surface tags enable a specific analyte recognition as well as a controlled pore permeability. Among all the different types of nanocontainers, liposomes excel by their relatively simple preparation and surface functionalization, their large inner cavity and variety of possible entrapped molecules, short assay response times due to an efficient lysis of the membrane, promising multimodal approaches for clinical diagnosis and therapy as well as by their natural biocompatibility and are thus of major interest in the field of (bio)analysis (Chapter 1).
For all applications in this area a careful control of the vesicle surface is necessary as it not only provides colloidal stability in complex aqueous solutions but also enables a specific binding to surfaces or the recognition of the analyte of interest. Therefore, the surface charge as well as methods for the introduction of specific functionalities were studied in detail in this thesis and the developed liposomes characterized and investigated towards their applicability as signal enhancers for the detection of bacteria or the preconcentration of DNA.
Standard methods for the surface functionalization of liposomes via covalent coupling post synthesis or modification directly during synthesis using functionalized lipids result in the production of numerous functionalized liposomes suitable for many applications. However, due to the need for elevated temperatures and organic solvents, time-consuming preparation and purification steps, low coupling yields, crosslinking or the decoration of the inner and outer leaflet of the bilayer, these methods are accompanied by a comparatively high loss of functionalities and are often unsuitable for fragile moieties. Moreover, large variations in the insertion efficiency, high batch-to-batch differences, and an incorporation limit of 4 mol% in case of direct modification with DPPE-biotin during synthesis were observed. Therefore, an alternative strategy for the insertion of different anchor molecules into dye-loaded liposomes composed of DPPC, DPPG and cholesterol was developed, and the tested molecules studied for their ability to effectively insert into the lipid bilayer and their binding functionality. The best system (lipopeptide-biotin) provided a fast, concentration-controlled functionalization up to 10 mol% in aqueous solution at room temperature and a reliable and quantitative binding to streptavidin with no effect on the analytical properties of the vesicles. Thus, the vesicles only differ by the type or concentration of the functional moiety on the liposome surface which provides a huge potential for applications in the development of bioanalytical assays or for multi-analyte detection but can also be extended to other lipid-based nanomaterials and general analytical or pharmaceutical applications (Chapter 3).
Standard characterization of liposomes includes the determination of the vesicle size, ζ-potential and phospholipid concentration. However, there are several other parameters that can be investigated, such as the number of particles and surface tags or the specific binding of the vesicles to particles or surfaces. Therefore, ssDNA-tagged liposomes were prepared and characterized in detail using the standardly applied methods like DLS or ICP-OES as well as other optical methods. The number of liposomes was e.g. successfully determined via fluorescence correlation spectroscopy. Moreover, a hybridization assay with a fluorophore-tagged complementary oligonucleotide strand was developed to determine the number of ligands on the vesicle surface. In addition, fluorescence microscopy confirmed e.g. a successful purification, the specific binding of the functionalized vesicles to magnetic microparticles and enabled the imaging of the ideal lysis conditions for the applied liposomes (22 mM OG). Also the superior performance of liposomes over simple fluorophore-tagged oligonucleotides with respect to signal amplification was successfully demonstrated (Chapter 4).
The ability of liposomes to strongly enhance signals has already been exploited for many different bioanalytical assays. Here, mainly anionic lipid vesicles are applied as they prevent non-specific binding to most biological molecules or surfaces. The use of cationic liposomes is mainly restricted to pharmaceutical applications, such as in gene delivery. Therefore, a different approach for the use of dye-loaded cationic liposomes has been developed which is based on their electrostatic binding to the negatively charged surface of the model bacterium E.coli. Two different assay concepts were investigated and optimized to exploit this interaction for the detection of E.coli. The first concept is based on centrifugation and the second one on the immobilization of the bacteria to Poly-L-Lysin-coated microtiter plates. Sulforhodamine B-loaded liposomes enabled the analysis via fluorescence and yielded detection limits between 106 and 107 cfu ml-1. This was further improved by the entrapment of the chemiluminescent marker m-carboxy-luminol. Here, detection limits of ~105 cfu ml-1 were achieved using the centrifugation-based assay. As most bacteria provide a negative surface charge, this method offers the possibility for a simple and universal detection of gram-positive and gram-negative bacteria. However, further optimizations will be necessary to achieve lower limits of detection (Chapter 5).
Besides their use for bacteria detection, preliminary studies also revealed the suitability of cationic liposomes for the preconcentration of genomic DNA. Preconcentration of analytes is a common tool in analytical chemistry and often described for DNA samples. Here, PCR, alcohol precipitation and magnetic beads belong to the most common methods. As in case of bacteria also DNA is negatively charged due to its phosphate backbone. This enables the electrostatic attachment to the cationic vesicle surface. For separation two concepts were investigated. The first concept based on the separation via magnetic beads resulted in only low enrichment factors of ~2. The second concept was based on centrifugation. Here, an incubation time of only 5 min followed by centrifugation for 15 min at 15.000 g resulted in an efficient preconcentration of genomic DNA with enrichment factors up to 75. Thus, these preliminary studies show that cationic liposomes are a promising material in the field of DNA preconcentration and may be able to overcome some of the disadvantages of other methods, such as the need for organic solvents or chaotropic salts (Chapter 6).
Translation of the abstract (German)
Nanocontainer werden für zahlreiche bioanalytische Strategien eingesetzt, z.B. in Bioassays, in Chemosensoren oder für die Bildgebung und in vivo Anwendungen. Sie variieren in Bezug auf die verwendeten Materialen (wie z.B. mesoporöses Siliziumdioxid, Polymere oder Proteine). Diese bestimmen die spezifischen Eigenschaften vor allem durch ihre Hohlräume und Poren für den Einschluss zahlreicher ...
Translation of the abstract (German)
Nanocontainer werden für zahlreiche bioanalytische Strategien eingesetzt, z.B. in Bioassays, in Chemosensoren oder für die Bildgebung und in vivo Anwendungen. Sie variieren in Bezug auf die verwendeten Materialen (wie z.B. mesoporöses Siliziumdioxid, Polymere oder Proteine). Diese bestimmen die spezifischen Eigenschaften vor allem durch ihre Hohlräume und Poren für den Einschluss zahlreicher Signalmoleküle und ihre große Oberfläche für das Anbringen von Oberflächenfunktionalitäten. Ihre Fähigkeit zur Signalverstärkung ist hierbei von besonderem Interesse, wobei funktionelle Gruppen an der Oberfläche sowohl eine spezifische Erkennung des Analyten als auch eine kontrollierte Porendurchlässigkeit ermöglichen. Unter all den verschiedenen Arten von Nanocontainern stechen Liposomen durch ihre relative leichte Herstellung und Oberflächenmodifizierung, ihren großen inneren Hohlraum und die Vielzahl an einschließbaren Molekülen, kurze Assay-Antwortzeiten durch effizientes Lysieren der Membran, vielversprechende multimodale Ansätze für die klinische Diagnostik und Therapie, sowie durch ihre natürliche Biokompatibilität heraus. Sie sind daher von großem Interesse für die (Bio)analytik (Kapitel 1).
Für alle Anwendungen auf diesem Gebiet ist eine sorgfältige Kontrolle der Vesikeloberfläche nötig, da sie nicht nur die kolloidale Stabilität in komplexen, wässrigen Lösungen, sondern auch die spezifische Bindung an Oberflächen oder die Erkennung des Ziel-Analyten ermöglicht. Daher wurde in dieser Arbeit sowohl die Ladung der Liposomoberfläche als auch das Einführen spezifischer Funktionalitäten im Detail untersucht, die entwickelten Liposomen charakterisiert und in Bezug auf ihre Anwendbarkeit als Signalverstärker für die Detektion von Bakterien oder für das Aufkonzentrieren von DNA analysiert.
Standardmethoden für die Oberflächenfunktionalisierung über kovalente Kopplung nach der Synthese oder über direkte Modifizierung während der Synthese mit Hilfe von funktionalisierten Lipiden führt zur Herstellung von zahlreichen, funktionalisierten Liposomen, die für verschiedenste Anwendungen geeignet sind. Allerdings kommt es bei diesen Methoden durch die Notwendigkeit für erhöhte Temperaturen und organische Lösungsmittel, die zeitaufwendige Herstellung und Aufreinigung, niedrige Kopplungsraten, Quervernetzungen oder die Dekoration der äußeren und inneren Membranschicht zu einem verhältnismäßig großen Verlust an Funktionalitäten. Außerdem sind sie dadurch oft nicht für fragile Moleküle geeignet. Darüber hinaus wurden im Fall der direkten Modifizierung mit DPPE-biotin während der Synthese große Variationen in der Einbaueffizienz, hohe Unterschiede zwischen verschiedenen Ansätzen und eine Einbaugrenze von 4 mol% beobachtet. Daher wurde eine alternative Strategie für den Einbau unterschiedlicher Ankermoleküle in Farbstoff-beladene Liposomen aus DPPC, DPPG und Cholesterol entwickelt und die untersuchten Moleküle in Hinblick auf ihre Fähigkeit effektiv in die Lipiddoppelschicht zu insertieren und auf ihre Bindungsfunktionalität hin analysiert. Das beste System (Lipopeptid-biotin) ermöglichte eine schnelle, konzentrations-kontrollierte Funktionalisierung bis zu 10 mol% bei Raumtemperatur in wässriger Lösung und eine zuverlässige, quantitative Bindung an Streptavidin, ohne dabei die analytischen Eigenschaften der Vesikel zu beeinflussen. Daher unterscheiden sich die Vesikel ausschließlich durch die Art oder Konzentration des funktionellen Restes an der Liposomoberfläche, was ein großes Potential für Anwendungen im Bereich der Entwicklung von bioanalytischen Assays oder der Multi-Analyt-Detektion ermöglicht. Darüber hinaus kann diese Methode auch auf andere Lipid-basierte Nanomaterialien oder auf allgemeine analytische oder pharmazeutische Anwendungen ausgeweitet werden (Kapitel 3).
Die standardmäßige Charakterisierung von Liposomen beinhaltet die Bestimmung der Vesikelgröße, ihres ζ-Potentials und ihrer Phospholipidkonzentration. Es gibt allerdings zahlreiche andere Parameter, die ebenfalls untersucht werden können, sowie die Anzahl an Partikeln und Oberflächenfunktionalitäten oder die spezifische Bindung der Vesikel an Partikel oder Oberflächen. Dazu wurden ssDNA-markierte Liposomen hergestellt und im Detail charakterisiert, wobei sowohl Standardmethoden wie DLS oder ICP-OES zum Einsatz kamen als auch andere optische Methoden. Die Anzahl an Liposomen wurde beispielsweise erfolgreich über Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie ermittelt. Darüber hinaus wurde ein Hybridisierungsassay mit einem Fluorophor-markierten, komplementären Oligonukleotidstrang entwickelt, um die Anzahl an Liganden auf der Vesikeloberfläche zu bestimmen. Außerdem bestätigte die Fluoreszenzmikroskopie beispielsweise eine erfolgreiche Aufreinigung, die spezifische Bindung der funktionalisierten Liposomen an magnetische Mikropartikel und ermöglichte die Bildgebung der idealen Lyse-Bedingungen für die angewendeten Liposomen (22 mM OG). Die überlegene Performance der Liposomen im Vergleich zu einfachen Fluorophor-markierten Oligonukleotiden in Bezug auf eine Signalverstärkung wurde ebenfalls erfolgreich gezeigt. (Kapitel 4).
Die Fähigkeit von Liposomen, Signale kräftig zu verstärken, wurde bereits für eine Vielzahl an bioanalytischen Assays genutzt. Dazu wurden hauptsächlich anionische Lipidvesikel verwendet, da sie eine unspezifische Bindung an die meisten biologischen Moleküle und Oberflächen verhindern. Der Einsatz von kationischen Liposomen ist hauptsächlich auf pharmazeutische Anwendungen beschränkt, wie z.B. für den Gentransfer. Daher wurde ein anderer Ansatz für den Einsatz von Farbstoff-beladenen, kationischen Liposomen entwickelt, welcher auf der elektrostatischen Bindung an die negativ geladene Oberfläche des Modell-Bakteriums E.coli beruht. Es wurden zwei verschiedene Assay-Konzepte untersucht und optimiert, um diese Wechselwirkung für den Nachweis von E.coli zu verwenden. Das erste Konzept basiert auf Zentrifugation und das zweite auf der Immobilisierung der Bakterien an Poly-L-Lysin-überzogene Mikrotiterplatten. Sulforhodamin B-beladene Liposomen ermöglichten die Analyse über Fluoreszenz und erzielten Detektionsgrenzen zwischen 106 und 107 cfu ml-1. Das wurde weiter verbessert durch den Einschluss des chemilumineszenten Markers m-Carboxyluminol. Damit wurde mit Hilfe des Zentrifugation-basierten Assays eine Detektionsgrenze von ~105 cfu ml-1 erreicht. Da die meisten Bakterien eine negative geladene Oberfläche besitzen, bietet diese Methode die Möglichkeit für eine einfache und universelle Detektion sowohl von gram-positiven als auch von gram-negativen Bakterien. Allerdings werden weitere Optimierungen nötig sein, um noch niedrigere Detektionsgrenzen zu erreichen (Kapitel 5).
Neben ihrer Verwendung für die Bakteriendetektion, zeigen erste Studien auch die Eignung von kationischen Liposomen für die Aufkonzentrierung von genomischer DNA. Das Aufkonzentrieren von Analyten ist ein weit verbreitetes Mittel in der analytischen Chemie und wird häufig für DNA-Proben beschrieben. Dabei gehören die PCR, die alkoholische Fällung und die Verwendung magnetischer Beads zu den bekanntesten Methoden. Wie im Fall von Bakterien ist auch DNA aufgrund ihres Phosphat-Rückgrats negativ geladen. Dies ermöglicht eine elektrostatische Bindung an die Oberfläche der kationischen Vesikel. Für die Abtrennung ungebundener DNA wurden zwei Konzepte untersucht. Das erste Konzept, welches auf der Abtrennung über magnetische Beads basiert, erzielte nur geringe Aufkonzentrierungsfaktoren von ~2. Das zweite Konzept basiert auf Zentrifugation. Dabei resultierten eine Inkubationszeit von nur 5 min, gefolgt von Zentrifugation für 15 min bei 15.000 g in einer effizienten Aufkonzentrierung genomischer DNA mit Aufkonzentrierungsfaktoren bis zu 75. Diese ersten Studien zeigen daher, dass kationische Liposomen ein vielversprechendes Material im Bereich der DNA-Aufkonzentrierung sind und möglicherweise einige Nachteile der anderen Methoden, wie z.B. die Notwendigkeit für organische Lösungsmittel oder chaotrope Salze, beseitigen können (Kapitel 6).
Metadata last modified: 25 Nov 2020 17:35
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