| Lizenz: Creative Commons Namensnennung 4.0 International (7MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-409860
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.40986
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 6 November 2019 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Frank Sprenger |
| Tag der Prüfung: | 16 Oktober 2019 |
| Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Cell Cycle Control > Prof. Dr. Frank Sprenger |
| Stichwörter / Keywords: | Skp2, Dap, Cdt1, CycE, Drosophila melanogaster, cell cycle, flow cytometry |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 40986 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Der proteasomale Abbau von Proteinen ist einer von vielen Wegen, wie eine Zelle die verschiedensten Prozesse für ein physiologisches Gleichgewicht und den korrekten Ablauf lenken kann. Insbesondere spielt er für die Regulation des Zellzyklus eine wichtige Rolle, da es dadurch möglich wird, Proteine zeitgenau und schnell abzubauen. Hauptbestandteil des proteasomalen Abbaus sind E3-Ubiquitin ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Der proteasomale Abbau von Proteinen ist einer von vielen Wegen, wie eine Zelle die verschiedensten Prozesse für ein physiologisches Gleichgewicht und den korrekten Ablauf lenken kann. Insbesondere spielt er für die Regulation des Zellzyklus eine wichtige Rolle, da es dadurch möglich wird, Proteine zeitgenau und schnell abzubauen. Hauptbestandteil des proteasomalen Abbaus sind E3-Ubiquitin Ligasen, die Ubiquitin-Moleküle auf die entsprechenden Proteinsubstrate übertragen, was schlussendlich dazu führt, dass das Proteasom diese erkennt und abbaut. Eine bekannte E3-Ubiquitin Ligase, die auch wichtige Aufgaben während des Zellzyklus erfüllt, ist der SCF-Komplex. Ein Teil des SCF-Komplexes, die F-Box Proteine, sind verantwortlich für die Erkennung der Substrate.
Skp2 ist eines der am besten untersuchten F-Box Proteine in höheren Eukaryoten und hat eine große Bandbreite an Substraten. Vielleicht die wichtigsten Substrate sind p21, p27 und p57, Inhibitoren von Cyclin-abhängigen Kinasen (CKI), die sich verantwortlich zeichnen für die Inhibierung der Aktivität des CycE/Cdk2 Komplexes. Diese CKIs üben dabei eine regulatorische Funktion beim Übergang von der G1- in die S-Phase aus. Während des Zellzyklus sorgt SCFSkp2 für die Ubiquitinierung und anschließendem proteasomalen Abbau, was zu Aktivität von CycE/Cdk2 und Beginn der S-Phase führt. Andere Substrate von Skp2 sind zum Beispiel Cdt1, notwendig für die Lizensierung von Replikations-Origins und geordneter DNA Replikation, oder CycE, welches die Cyclin-abhängige Kinase 2 aktiviert. Im Vergleich dazu ist Skp2 in Drosophila melanogaster nur wenig beschrieben. Bis jetzt ist nur Dacapo als Substrat vorgeschlagen, das Homolog zu p21, p27 und p57, jedoch ist in diesem Fall die Datenlage nicht eindeutig.
In dieser Doktorarbeit werden die Effekte von Skp2 in Drosophila Schneider Zellen untersucht und neue Interaktionspartner von Skp2 ermittelt. Eingesetzt wurden hierzu Untersuchungen zur Zellzyklusverteilung, Live Cell Imaging Experimente, Untersuchungen zur biochemischen Interaktion, massenspektrometrische Analyse von Skp2 Bindungspartnern und Untersuchungen der Proteinstabilität mittels Durchflusszytometrie, ein Ansatz, der in der Arbeitsgruppe Sprenger entwickelt wurde.
Überexpression von Skp2 resultierte in einer verlängerten G1-Phase, der Knockdown hingegen in einem schnelleren Übergang von G1 nach S. Dieses Ergebnis, zusammen mit der Erkenntnis, dass die Dap Stabilität unempfindlich gegenüber Veränderungen der Skp2 Level war, dass die Interaktion zwischen Skp2 und Dap nicht eindeutig bestimmbar war und das Skp2 den Zellzyklusphänotyp von Dap verstärkte, zeigt, dass ein negativer Effekt von Skp2 auf Dap sehr unwahrscheinlich ist. Stattdessen zeigte sich, dass Cdt1 in Fliegen wahrscheinlich ein neues Substrat von SCFSkp2 sein könnte. Die Ergebnisse deuteten auch darauf hin, dass Cdt1 für diese Interaktion phosphoryliert sein muss und Experimente wurden ausgeführt um die verantwortlichen Phosphorylierungsstellen zu identifizieren. Für CycE hingegen war es nicht möglich eine Regulation der Proteinstabilität mit Sicherheit festzustellen, obwohl eine biochemische Interaktion ermittelt werden konnte. Die massenspektrometrische Analyse von Skp2 Bindungspartnern konnte keine neuen Substrate von Skp2 identifizieren.
Im Gegensatz zum derzeitigen Wissensstand scheint Dap kein Substrat von SCFSkp2 zu sein. Auf der anderen Seite scheint Cdt1 als ein neues Substrat von Skp2 in D. melanogaster identifiziert worden zu sein. Weitere Experimente werden zeigen, welche Phosphorylierungsstellen in diesem Zusammenhang wichtig sind. Diese Ergebnisse werfen ein neues Licht auf die Rolle, die Skp2 im Zellzyklus von Drosophila spielt.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Proteasomal degradation of proteins is one of many ways for a cell to regulate different processes to achieve cell homeostasis and correct functioning. It is especially important for cell cycle regulation, since it allows for timely, rapid degradation of proteins. Key players of proteasomal degradation are E3 ubiquitin ligases that transfer ubiquitin molecules to the respective substrate ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Proteasomal degradation of proteins is one of many ways for a cell to regulate different processes to achieve cell homeostasis and correct functioning. It is especially important for cell cycle regulation, since it allows for timely, rapid degradation of proteins. Key players of proteasomal degradation are E3 ubiquitin ligases that transfer ubiquitin molecules to the respective substrate proteins, which ultimately lead to recognition by the proteasome and degradation of said proteins. A prominent E3 ubiquitin ligase that also has important tasks in cell cycle regulation is the SCF-complex. One part of the SCF-complex, the F-Box proteins, fulfill the role of substrate recognition subunits.
Skp2 is one of the most characterized F-Box proteins in higher eukaryotes, with a broad range of different substrates. Perhaps the most important are p21, p27 and p57, cyclin dependent kinase inhibitors (CKI) that are responsible for inhibition of the activity of the CycE/Cdk2 complex. These CKIs are thereby exerting a regulatory function in the transition from G1- to S-Phase. In the cell cycle, SCFSkp2 does target the three CKIs for ubiquitination and subsequent proteasomal degradation, resulting in CycE/Cdk2 activity and beginning of S-Phase. Other substrates of Skp2 are for example Cdt1, necessary for the licensing of origin of replications and ordered DNA replication, or CycE, which activates the Cyclin dependent kinase 2. Skp2 in Drosophila melanogaster is poorly characterized, in comparison. Only one substrate has been proposed up to date, the p21, p27 and p57 homologue Dacapo, although the data availability is not definite in this case.
This thesis centers on the characterization of Skp2 in Drosophila Schneider cells and the search for new Skp2 interaction partners in the fly. This was achieved by analysis of the cell cycle distribution, live cell imaging experiments, biochemical interaction assays, mass-spectrometric analysis of Skp2 binding partners and protein stability analysis by flow cytometry, which was developed in the Sprenger group.
Skp2 overexpression resulted in a longer G1-Phase, knockdown in faster transition from G1 to S. This result together with the impassivity of Dap stability upon modulation of Skp2 levels, the inconclusive interaction between Skp2 and Dap and the outcome that Skp2 enhanced the Dap cell cycle phenotype makes it highly unlikely that Dap is negatively regulated by Skp2. Instead, experiments showed that Cdt1 is probably a substrate of SCFSkp2 in Drosophila. The results also hinted that Cdt1 has to be phosphorylated for this interaction and experiments were undertaken to identify the responsible phosphorylation sites in Cdt1. For CycE on the other hand it was not possible to determine regulation of protein stability by Skp2 with certainty even though biochemical interaction could be seen. The mass-spectrometric analysis of Skp2 binding partners did not identify new substrates of Skp2.
In opposition to the state of knowledge, Dap seems to be not a substrate of the SCFSkp2 ubiquitin ligase. Cdt1 on the other hand seems to be a new target of Skp2 in D. melanogaster and further work will reveal the phosphorylation sites necessary for this relationship. These results shed new light on the role that Skp2 has on the Drosophila cell cycle.
Metadaten zuletzt geändert: 25 Nov 2020 17:23
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