| License: Publishing license for publications excluding print on demand PDF - Accepted Version (2MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-410006
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.41000
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 11 November 2019 |
| Referee: | Prof. Dr. Anja Boßerhoff |
| Date of exam: | 29 October 2019 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Pathologie |
| Keywords: | Melanozyten, Seneszenz, Melanom, MIA |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Partially |
| Item ID: | 41000 |
Abstract (German)
In vorangegangen Studien konnte gezeigt werden, dass MIA (melanoma inhibitory activity) von Melanomzellen stark exprimiert und sekretiert wird, jedoch nicht von Melanozyten. MIA bindet dabei an Komponenten der extrazellulären Matrix und ist dadurch an der Invasion, Metastasierung und Progression des malignen Melanoms beteiligt. Entsprechend korreliert der MIA-Serumspiegel von Melanompatienten mit ...
Abstract (German)
In vorangegangen Studien konnte gezeigt werden, dass MIA (melanoma inhibitory activity) von Melanomzellen stark exprimiert und sekretiert wird, jedoch nicht von Melanozyten. MIA bindet dabei an Komponenten der extrazellulären Matrix und ist dadurch an der Invasion, Metastasierung und Progression des malignen Melanoms beteiligt. Entsprechend korreliert der MIA-Serumspiegel von Melanompatienten mit der Progression der Erkrankung. In Vordaten zu dieser Arbeit konnte jedoch für MIA auch tumorsuppressive Effekte nachgewiesen werden, die im Zusammenhang mit dem Mechanismus der zellulären Seneszenz stehen. Bei zellulärer Seneszenz handelt sich um einen permanenten Wachstumsarrest, der durch verschiedene Stimuli wie beispielsweise Verkürzung der Telomere (replikative Seneszenz) oder aktivierende Onkogene (Onkogen-induzierte Seneszenz, OIS) ausgelöst werden kann.
Erste Ergebnisse der vorliegenden Arbeit bestätigten, dass MIA in hohen Passagen (replikative Seneszenz) von normalen humanen epidermalen Melanozyten (NHEM) exprimiert wird und diese Expression mit der Anzahl seneszenter Zellen korreliert. Die Induktion der MIA-Expression konnte im weiteren Verlauf der Arbeit auch für verschiedene Modelle der OIS detektiert werden. So führte im humanen System die lentivirale Überexpression von B-RafV600E in NHEM zu einem seneszenten Phänotyp und erhöhter MIA-Expression. Ebenso konnte in einem murinen Modellsystem, der murinen Melanozytenzelllinie Melan A, die das EGFR-Ortholog Xiphophorus melanoma receptor kinase (Xmrk) stark überexprimiert und somit Seneszenz auflöst, eine verstärkte MIA-Expression detektiert werden.
Durch die Überexpression von MIA in NHEM und Behandlung von NHEM mit rekombinantem MIA sollte die Funktion von MIA bei der Induktion von Seneszenz geklärt werden. Sowohl nach Überexpression als auch nach Behandlung mit rekombinantem MIA konnte keine Veränderung in der Anzahl der seneszenten Zellen, im Proliferationsverhalten oder in der Genexpression Zellzyklusinhibitoren p14, p15, p16, p21 und p27 detektiert werden, was zur Hypothese führte, dass MIA allein nicht ausreichend ist, um Seneszenz zu induzieren. Da die bisherigen Daten aber auf einen Zusammenhang zwischen MIA und Seneszenz hinwiesen, wurde der Einfluss eines Knockdowns von MIA auf den seneszenten Zustand in B-RafV600E-transduzierten NHEM überprüft. In diesem Versuchsansatz wurde eine Reduktion der prozentualen Anzahl seneszenter Zellen und eine Erhöhung der Zellproliferation im Vergleich zu B-RafV600E-transduzierten NHEM festgestellt, was einen Einfluss von MIA auf die Aufrechterhaltung von Seneszenz nahelegt.
In in vivo Vordaten zu dieser Arbeit wurde bereits die Kreuzung des Tg(Grm1) Melanommausmodell mit einer MIA-defizienten Mauslinie (MIA-/-) etabliert. Interessanterweise wiesen die Tg(Grm1)/MIA-/- Mäuse ein signifikant früheres Tumor-Onset als die Tg(Grm1)-Kontrolltiere auf. Für die vorliegende Arbeit wurden aus den beschrieben Mäusen murine Melanozyten isoliert. Dabei wiesen die Melanozyten aus MIA-defizienten Tieren ein signifikant höheres Proliferationsverhalten als die entsprechenden Kontrolltiere auf. Anschließende Analysen an Hautproben von MIA-defizienten Melanommäusen und entsprechenden Kontrollmelanommäusen ergaben sowohl im tumorfreien als auch tumorösen Gewebe bei den Tg(Grm1)/MIA-/- Mäuse eine reduzierte p21-Expression. P21 ist neben den anderen bereits erwähnten Zellzyklusinhibitoren an der Regulation des Zellzyklus beteiligt und kann dadurch einen Wachstumsarrest und Seneszenz auslösen. Einen Einfluss von MIA auf die p21-Expression konnte zudem in in vitro Experimenten nachgewiesen werden, in denen der Knockdown von MIA in NHEM in hohen Passagen zu reduzierten p21 Proteinleveln führte. Im Gegensatz dazu lässt sich dieser regulatorische Effekt von MIA auf p21 im Melanom (untersucht an den Melanomzelllinien Mel Im und WM35) nicht mehr nachweisen. Aufgrund der erhöhten Expression der Telomerase in Tumorzellen und der beschriebenen Regulation der p21-Expression durch die Telomerase-Reverse-Transkriptase (TERT) wurde die Hypothese aufgestellt, dass es sich bei der Regulation von p21 im Melanom durch die Expression von TERT um einen vorgeschalteten Signalweg handelt und somit der Knockdown von MIA im Melanom keinen Einfluss auf die Expressionslevel von p21 hat. Experimente mit einer immortalisierten Melanozytenzelllinie (Mel-STV), die TERT stabil exprimiert, legten die Vermutung nahe, dass durch die Expression von TERT die B-RafV600E-vermittelte Induktion von MIA verhindert wird und bestätigt die zuvor aufgestellte Theorie, dass TERT in der Signalkaskade vor MIA liegt.
Diese Arbeit beschreibt zum ersten Mal, dass die MIA-Expression in Melanozyten und im Melanom unterschiedliche Auswirkungen hat. Es konnte gezeigt werden, dass MIA in Melanozyten die replikative Seneszenz über die Regulation von p21 beeinflussen kann und darüber hinaus an der Aufrechterhaltung der Onkogen-induzierten Seneszenz beteiligt ist. Neben den bereits beschriebenen protumorigenen Eigenschaften von MIA konnten somit erstmals regulatorische Effekte von MIA auf zelluläre Seneszenz detektiert und folglich eine neue biologische Funktion von MIA identifiziert werden.
Translation of the abstract (English)
Previous studies revealed that MIA (melanoma inhibitory activity) is strongly expressed and secreted by melanoma cells but not by melanocytes. MIA binds to components of the extracellular matrix and thereby promotes invasion, metastasis and progression of malignant melanoma. Correspondingly, MIA serum levels of melanoma patients correlate with the progression of the disease. However, in ...
Translation of the abstract (English)
Previous studies revealed that MIA (melanoma inhibitory activity) is strongly expressed and secreted by melanoma cells but not by melanocytes. MIA binds to components of the extracellular matrix and thereby promotes invasion, metastasis and progression of malignant melanoma. Correspondingly, MIA serum levels of melanoma patients correlate with the progression of the disease. However, in preliminary data on this work tumor suppressive effects associated with the mechanism of cellular senescence could also be demonstrated for MIA. Cellular senescence is a permanent growth arrest that can be triggered by various stimuli, such as shortening telomeres (replicative senescence) or activating oncogenes (oncogene-induced senescence, OIS).
First results confirmed that MIA is expressed in high passages (replicative senescence) of normal human epidermal melanocytes (NHEM) and its expression correlates with the number of senescent cells. Induction of MIA expression could also be detected in different models of OIS. Lentiviral overexpression of B-RafV600E in NHEM caused a senescent phenotype and increased MIA expression. Likewise, an increased MIA expression could be detected in a murine model system, the murine melanocyte cell line melan A, which strongly overexpresses the EGFR orthologue Xiphophorus melanoma receptor kinase (Xmrk) and thus induces senescence.
By overexpression of MIA in NHEM and treatment of NHEM with recombinant MIA, the function of MIA in the induction of senescence should be clarified. After overexpression of MIA or treatment with recombinant MIA we could not detect a change in number of senescent cells, in proliferative potential or in gene expression of cell cycle inhibitors p14, p15, p16, p21 and p27, which led to the hypothesis that MIA alone is insufficient to induce senescence. However, as previous data suggested a link between MIA and senescence, the impact of knockdown of MIA on the senescent state in B-RafV600E-transduced NHEM was examined. In this experiment, a reduction in the percentage of senescent cells and an increase in cell proliferation compared to B-RafV600E-transduced NHEM was found, suggesting an influence of MIA on the maintenance of senescence.
In vivo preliminary data on this work already established the crossing of the Tg (Grm1) melanoma model with a MIA-deficient mouse line (MIA-/-). Interestingly, Tg(Grm1)/MIA-/- mice had a significantly earlier tumor onset than the Tg (Grm1) control animals. For the present work, murine melanocytes were isolated from the described mice. Melanocytes from MIA-deficient animals had a significantly higher proliferation potential than corresponding control animals. Subsequent analyzes on skin samples of MIA-deficient melanoma mice and corresponding control melanoma mice revealed reduced p21 expression in both the tumor-free and tumorous tissues in the Tg(Grm1)/MIA-/- mice. P21 is involved in the regulation of cell cycle and can thereby trigger a growth arrest and senescence. In addition, an influence of MIA on p21 expression could be demonstrated in in vitro experiments in which the knockdown of MIA in NHEM in high passages resulted in reduced p21 protein levels. In contrast, we weren’t able to detect this regulatory effect of MIA on p21 in melanoma (examined on the melanoma cell lines Mel Im and WM35). Due to increased expression of telomerase in tumor cells and the described regulation of p21 expression by telomerase reverse transcriptase (TERT), it has been hypothesized that the regulation of p21 in melanoma by expression of TERT is an upstream signaling pathway. Thus, the knockdown of MIA in melanoma has no effect on the expression levels of p21. Experiments with an immortalized melanocyte cell line (Mel-STV) stably expressing TERT suggested that the expression of TERT prevented B-RafV600E-mediated induction of MIA and confirmed the theory that TERT is upstream of MIA in the signaling pathway.
This work describes for the first time that MIA expression in melanocytes and in melanoma has different effects. It has been shown that MIA in melanocytes can influence the replicative senescence via the regulation of p21 and is also involved in the maintenance of oncogene-induced senescence. In addition to the previously described pro-tumorigenic properties of MIA, it was possible for the first time to detect regulatory effects of MIA on cellular senescence and consequently to identify a new biological function of MIA.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 17:22
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