| Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Publikationen ohne Print on Demand (4MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-410204
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.41020
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 30 November 2021 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Antje J. Bäumner |
| Tag der Prüfung: | 30 Oktober 2019 |
| Institutionen: | Chemie und Pharmazie > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik Chemie und Pharmazie > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik > Chemo- und Biosensorik (Prof. Antje J. Bäumner, ehemals Prof. Wolfbeis) |
| Stichwörter / Keywords: | liposomes, magnetic nanoparticles, bioanalysis, microfluidics, DNA sandwich hybridization assay |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 41020 |
Zusammenfassung (Englisch)
Daily, Consumers all over the world have to rely on the security and high quality of food, which emphasizes the importance and high demand of fast reliable strategies for food safety analysis. These enable us to control the safety of consumable goods during production as well as directly in the supermarket or at home. Recent progress in development of these strategies with focus on the employed ...
Zusammenfassung (Englisch)
Daily, Consumers all over the world have to rely on the security and high quality of food, which emphasizes the importance and high demand of fast reliable strategies for food safety analysis. These enable us to control the safety of consumable goods during production as well as directly in the supermarket or at home. Recent progress in development of these strategies with focus on the employed biological and synthetic macro- and nanomaterials are examined in this thesis, systematically comparing their advantages and disadvantages. When taking into account less recent literature, it was found that a rethink of useful detection strategies takes place, which is expressed in the fact that purely lab-based strategies are becoming less common, while point-of-need methods are proliferating. This progress involves extensive investigations in sophisticated synthetic materials with much higher research and production effort than biological materials, but will eventually lead to higher field portability and the possibility to enhance food safety directly at the spot where it is needed.
One of the synthetic materials used for food safety analysis are liposomes. These hollow vesicles can encapsulate huge amounts of marker molecules and set them free again after analyte recognition, reaching enormous signal amplification with each binding event. By equipping fluorescent liposomes with magnetic properties, multifunctional labels for the application in analytical assays are obtained, which can overcome diffusion limits due to directed approach under magnetic conditions, and thus can improve assay times as well as sensitivity. Two different strategies for the production of magnetic liposomes were investigated:
The first possibility is the incorporation of magnetic nanoparticles (MNPs) directly during synthesis: Either MNPs with hydrophobic surface coating were inserted into the hydrophobic core of the lipid bilayer (b-liposomes), or MNPs modified with hydrophilic surface ligands were incorporated into the likewise hydrophilic interior of the liposomes (i-liposomes). The resulting liposomes were characterized regarding their hydrodynamic diameter, zeta-potential and phospholipid concentration and optimization of lipid composition, synthesis strategy and work up procedure was conducted. The different systems were then validated by their performance in a DNA hybridization assay and compared between each other, before and after optimization, and with and without purification by further magnetic separation. Encapsulation efficiencies were determined to be 15% for b-liposomes and 5% for i-liposomes. In the DNA assay, it was found that the lowest limit of detection was obtained with optimized b-liposomes at 42 pM target DNA, which was over three times lower than without a magnetic field. Interestingly, when further clean-up procedures were employed and non-magnetic liposomes were sorted out, the overall LOD increased. A possible explanation is that without magnetic purification, non-magnetic liposomes are dragged towards the magnetic field by their magnetic peers and this positive contribution improves the assay performance. Furthermore, under these conditions, i-liposomes outperformed their bilayer counterparts, which is likely due to a lower fraction of liposomes with magnetic features and thus a higher potential for improvement. Eventually, both strategies represent viable possibilities for the production of magnetic liposomes.
A completely different strategy to obtain multifunctional fluorescent-magnetic liposomes is the external coupling of both components after synthesis, which bears a risk of increased unspecific binding, but also allows the use of larger magnetic particles with higher magnetization and the recombination of different ready-synthesized components. As the linkage in bulk solution yields, as expected, severe crosslinking, a microfluidic device was designed for the directed coupling of both species by magnetically immobilizing a confluent layer of magnetic particles at the bottom of the channel and enabling the binding of liposomes only from the top side while being flushed over the particles. The microfluidic channel was created from PMMA and double adhesive tape by laser cutting and channel design and flow rates were optimized to enhance binding capacities. Carboxy-modified liposomes and two differently sized amino-modified magnetic particles were employed, and the coupling efficiency in the microfluidic product was determined by fluorescence measurements after magnetic separation. The coupling with 1 μm magnetic beads was found to be 5 times more efficient than with smaller 30 nm MNPs and additionally 4 times more efficient than bilayer insertion. Nevertheless, both coupling products showed the ability to significantly improve the assay performance under magnetic conditions, when liposomes with additional biotin functionalization were used in a biotin-streptavidin-binding assay.
A possible application of the resulting magnetosomes is their use for immunomagnetic separation strategies. Thus, preliminary studies were conducted for the preconcentration of the HIV capsid protein p24, before a sandwich assay between magnetic microparticles, p24 and a fluorescent label was conducted followed by single particle fluorescence imaging. Unfortunately, we found that, possibly due to steric reasons, the binding of the concentrated liposome-p24 conjugate to magnetic particles was hindered. Therefore, a less lipophilic protein, neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL), was employed for further studies, which was expected to not interact in such a high degree with liposomes as p24 seemed to do. However, the same results as for p24 were yielded, and additionally it was found that the assay performance was much better for the direct binding of liposomes to magnetic particles than with NGAL as a sandwich. Nevertheless, using a preconcentration with liposomes, a two-fold increase of the signal could be achieved compared to an assay without preconcentration. As these were only preliminary studies, these are still promising results that highlight the great benefit of multifunctional fluorescent magnetic liposomes.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Täglich müssen sich weltweit Konsumenten drauf verlassen können, dass ihre Nahrung sicher und von hoher Qualität ist. Dies hebt die Bedeutung der Lebensmittelanalytik und den hohen Bedarf an schnellen zuverlässigen Methoden hervor, welche es uns ermöglichen, die Sicherheit der konsumierten Güter sowohl während der Produktion als auch direkt im Supermarkt oder zu Hause zu kontrollieren. Die ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Täglich müssen sich weltweit Konsumenten drauf verlassen können, dass ihre Nahrung sicher und von hoher Qualität ist. Dies hebt die Bedeutung der Lebensmittelanalytik und den hohen Bedarf an schnellen zuverlässigen Methoden hervor, welche es uns ermöglichen, die Sicherheit der konsumierten Güter sowohl während der Produktion als auch direkt im Supermarkt oder zu Hause zu kontrollieren. Die neuesten Fortschritte bei der Entwicklung dieser Strategien werden in dieser Arbeit untersucht und ihre Vor- und Nachteile systematisch abwogen, wobei ein besonderer Schwerpunkt auf den verwendeten biologischen und synthetischen Makro- und Nanomaterialien liegt. Im Vergleich mit weniger aktueller Literatur zu diesem Thema fällt auf, dass ein Umdenken bezüglich der nützlichsten Strategien stattfindet, was sich dadurch auszeichnet, dass rein laborbasierte Arbeitsweisen weniger häufig verwendet werden, während anwendernahe Methoden auf dem Vormarsch sind. Diese Entwicklung schließt die Notwendigkeit der intensiven Erforschung von immer ausgefeilteren synthetischen Substanzen mit höherem Forschungs- und Produktionsaufwand - verglichen mit biologischen Materialien - ein, wird aber letztendlich zu gesteigerter Transportfähigkeit führen und zu einer Erhöhung der Lebensmittelsicherheit an dem Punkt, an dem sie am dringendsten benötigt wird.
Eines dieser synthetischen Materialien, die für die Lebensmittelanalytik verwendet werden, ist das Liposom. Diese hohlen Vesikel können große Mengen von Markermolekülen einschließen und nach dem Erkennen des Analyten wieder freisetzen, was eine enorme Signalverstärkung für jede einzelne Bindung bedeutet. Stattet man nun fluoreszierende Liposomen mit magnetischen Eigenschaften aus, so erhält man multifunktionelle Marker für die Anwendung in analytischen Fragestellungen, welche Diffusionslimits durch die gerichtete Annäherung unter magnetischen Bedingungen außer Kraft setzen und damit sowohl die Analysezeit als auch die Sensitivität der Methode signifikant verbessern können. Zwei verschiedene Ansätze für die Herstellung dieser multifunktionellen Lipsomen wurden untersucht:
Die erste Möglichkeit ist die Einlagerung von magnetischen Nanopartikeln (MNPs) direkt während der Liposomsynthese. Hierbei wurden entweder MNPs mit hydrophober Oberflächenmodifikation in den genauso hydrophoben Kern der Lipiddoppelschicht eingelagert (b-Liposomen) oder MNPs, die mit einer hydrophilen Oberfläche ausgestattet wurden, in das ebenfalls hydrophile Innere der Liposomen eingeschlossen (i-Liposomen). Die entstandenen magnetisierten Liposomen wurden bezüglich ihres hydrodynamischen Durchmessers, ihres Zeta-Potentials und ihrer Phospholipidkonzentration charakterisiert und die Lipidzusammensetzung, die Synthesemethode und die Aufreinigung wurden optimiert. Die verschiedenen Systeme wurden dann anhand ihrer Effizienz in einem DNA-Hybridisierungsassay bewertet und miteinander vergleichen, einerseits sowohl vor als auch nach der Optimierung, andererseits mit und ohne Aufreinigung durch Trennung der magnetischen von den nicht-magnetischen Liposomen. Die Effizienz der Einlagerung von MNPs in die Liposomen wurde bestimmt und diese lag bei 15% für b-Liposomen und bei 5% für i-Liposomen. Im DNA-Assay wurde außerdem herausgefunden, dass das niedrigste zu erreichende Detektionslimit bei 42 pM Ziel-DNA lag, was über dreimal geringer war als ohne Magnetfeld. Interessanterweise stieg das Detektionslimit allgemein an, wenn als weiterer Aufreinigungsschritt eine Abtrennung der nicht-magnetisierten Liposomen vorgenommen wurde. Eine mögliche Erklärung hierfür ist, dass ohne magnetische Aufreinigung die nicht-magnetischen Liposomen von ihren magnetischen Partnern in Richtung des Magnetfeldes gezogen werden und dieser positive Beitrag die Leistung bei der Analyse verbessert. Zudem übertrafen i-Liposomen ihre b-Gegenstücke unter diesen Umständen, was vermutlich daran liegt, dass hier ein geringerer Anteil der Liposomen magnetisiert ist und damit ein größeres Verbesserungspotential besteht. Letztendlich stellen beide Systeme eine erfolgreiche Lösung für die Herstellung von magnetischen Liposomen dar.
Eine komplett andere Strategie um multifunktionelle fluoreszierende magnetische Liposomen zu erhalten verfolgt dagegen der Ansatz, beide Komponenten nach der Synthese extern aneinander zu koppeln. Dies birgt einerseits das Risiko für vermehrte unspezifische Bindungen, erlaubt es andererseits aber auch größere und damit stärker magnetisierte Partikel zu verwenden und verschiedene bereits vorsynthetisierte Komponenten immer wieder neu zu kombinieren. Wie erwartet wurde bei der Verknüpfung in großen Volumina gravierende Quervernetzung zwischen Liposomen und Partikeln beobachtet, weswegen ein mikrofluidisches Instrument entwickelt wurde, welches das kontrollierte Koppeln beider Komponenten ermöglicht. Dies wird realisiert, indem die Partikel magnetisch als durchgängige Schicht am Boden des Kanals immobilisiert werden und so die Bindung der Liposomen, die durch den Kanal fließen, nur von der Oberseite der Partikel erfolgen kann. Der Mikrofluidikkanal wurde aus Plexiglas und doppelseitigem Klebeband gefertigt, aus welchem der Kanal mithilfe eines Lasers ausgeschnitten wurde. Dieser wurde hinsichtlich des Designs des Kanals und der Fließgeschwindigkeit optimiert, um die Bindungskapazität zu erhöhen. Liposomen mit Carboxylgruppen und magnetische Partikel mit Aminogruppen an der Oberfläche wurden für die Bindung gewählt, und die Kopplungseffizienz des Mikrofluidikprudukts wurde durch Fluoreszenzmessungen nach magnetischer Abtrennung bestimmt. Es stellte sich heraus, dass die Kopplung von Liposomen an 1 μm große magnetische Teilchen etwa fünfmal so effizient ist wie die Kopplung an kleinere 30 nm große MNPs, und zusätzlich viermal effizienter als die Einlagerung von Partikeln in die Lipiddoppelschicht. Trotzdem zeigten beide Systeme bei der Verwendung von Liposomen mit zusätzlicher Biotinfunktionalisierung in Biotin-Streptavidin-Bindungsassays die Fähigkeit, das Analyseergebnis unter magnetischen Bedingungen signifikant zu verbessern.
Eine mögliche Anwendung der entstandenen Magnetosomen ist ihr Einsatz für immunomagnetische Abtrennungsstrategien. Deshalb wurden Vorläuferstudien durchgeführt, um das HIV-Kapselprotein p24 aufzukonzentrieren, bevor ein Sandwichassay zwischen magnetischen Mikropartikeln, p24 und einem Fluoreszenzlabel durchgeführt wurde, und vor der Detektion mithilfe von Einzelpartikel-Fluoreszenzimaging. Leider stelle sich heraus, dass - vermutlich aus sterischen Gründen - die Bindung des aufkonzentrierten Liposom-p24-Konjugats an die magnetischen Partikel gehemmt war. Deshalb wurde ein weniger lipophiles Protein, das Neutrophilengelatinase-assoziierte Lipocalin (NGAL), für weitere Studien eingesetzt, welches theoretisch nicht in solch hohem Grade mit den Liposomen interagieren sollte wie scheinbar p24. Jedoch wurden dieselben Ergebnisse wie für p24 erzielt, und zusätzlich herausgefunden, dass die Assayleistung wesentlich besser ist, wenn die Liposomen direkt an die magnetischen Partikel binden können als im Falle, dass NGAL dazwischengeschaltet wird. Nichtsdestotrotz wurde bei der Aufkonzentrierung mit Liposomen tatsächlich ein doppelt so hohes Signal erreicht wie bei einem Assay ohne Aufkonzentrierung. Da dies nur Vorläuferstudien waren, sind das trotz allem vielversprechende Ergebnisse, welche die großen Vorteile von multifunktionellen fluoreszierenden magnetischen Liposomen hervorheben.
Metadaten zuletzt geändert: 30 Nov 2021 08:13
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