Modifications of RNA bases are various and occur in almost all classes of RNA. Despite their abundance, most questions concerning RNA base modifications like the functions within the cell, remain elusive. To develop tools that can detect these modified bases is therefore an important step for helping to find answers to these questions. Especially issues concerning modification of the mRNA - the ...
Zusammenfassung (Englisch)
Modifications of RNA bases are various and occur in almost all classes of RNA. Despite their abundance, most questions concerning RNA base modifications like the functions within the cell, remain elusive. To develop tools that can detect these modified bases is therefore an important step for helping to find answers to these questions. Especially issues concerning modification of the mRNA - the transcriptome - are of high interest. Following the epigenetics, the new field of “epitranscriptomics” has evolved. Next generation sequencing has made the research in this direction a lot faster and easier. However, there are several caveats to this quick generation of vast amounts of sequencing data. Several groups already performed transcriptome-wide sequencing experiments using – among other methods – antibodies against modified RNA bases. For some of these analyses, the results vary immensely among different groups. This could be partly due to different behaviours of the used tools, besides the disparate data evaluation methods. Thus, the set goal was, to generate more sensitive and specific antibodies, than the available ones. For the generation, ovalbumin-coupled nucleosides were used as antigens. After testing in various assays and optimisation of RNA-IP protocols, several antibodies can now be used to enrich for certain modifications. In this thesis, functional antibodies against the RNA base-modifications m5C, m6A, Ψ and m26A are being presented and characterised. Different applications like immune fluorescence assays, and miCLIP (m6A individual-nucleotide-resolution cross-linking and immunoprecipitation) experiments are conceivable methods to apply the newly generated tools. Data from possible RIP-Seq (RNA-Immunoprecipitation and Sequencing) experiments could hint to consensus sequences in which the modifications mainly occur. These sequences could be one way to find proteins that bind to the modifications and eventually lead to the holistic function behind the different modified RNA bases. To discover some unknown specific binding proteins of modified bases, or “reader” proteins, was yet another task to accomplish in this thesis. For that, a pulldown technique, developed by colleagues in the laboratory was amended and optimised for these purposes. RNA hairpins containing the modified base of interest were used to precipitate the proteins, which were then identified via mass spectrometry.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
RNA Basenmodifikationen sind vielseitig und können in nahezu allen RNA-Arten auftreten. Trotz ihrer Häufigkeit sind viele Fragestellungen rund um die Modifikationen, wie zum Beispiel ihre Funktionen in der Zelle, noch nicht beantwortet. Ein Werkzeug zu entwickeln, mit dem man diese modifizierten RNA-Basen detektieren kann, ist daher wichtig, um dazu beizutragen, diesen Fragen auf den Grund zu ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
RNA Basenmodifikationen sind vielseitig und können in nahezu allen RNA-Arten auftreten. Trotz ihrer Häufigkeit sind viele Fragestellungen rund um die Modifikationen, wie zum Beispiel ihre Funktionen in der Zelle, noch nicht beantwortet. Ein Werkzeug zu entwickeln, mit dem man diese modifizierten RNA-Basen detektieren kann, ist daher wichtig, um dazu beizutragen, diesen Fragen auf den Grund zu gehen. Besonders interessant sind dabei natürlich die Modifizierungen der mRNA-Basen, also des Transkriptomes. Nach der Epigenetik hat sich nun auch das neue Themengebiet der “Epitranskriptomik” entwickelt. Die neuen Sequenziermethoden haben die Forschung in diesem Gebiet wesentlich schneller und einfacher gemacht. Allerdings gibt es mehrere Nachteile dieser schnellen Erzeugung von großen Mengen an Sequenzierdaten. Verschiedene Arbeitsgruppen haben bereits transkriptomweite Sequenzierexperimente durchgeführt, bei denen sie, unter anderem, Antikörper gegen RNA Basenmodifikationen verwendet haben. Die Ergebnisse dieser Analysen weichen teilweise sehr stark voneinander ab. Neben den verschiedenartigen Daten-Auswertungsmethoden, könnte der Grund dafür auch an den unterschiedlichen Verhaltensweisen der verwendeten Antikörper liegen. Ziel war es daher, Antikörper zu generieren, die sensibler und spezifischer als die kommerziell erhältlichen arbeiten. Als Antigene für die Erzeugung der Antikörper wurden Nukleosid-Ovalbumin-Konjugate verwendet. Nach diversen Tests und Optimierungsschritten der RNA-Immunopräzipitations-Experimente, können einige Antikörper nun zur Anreicherung bestimmter Modifikationen verwendet werden. In dieser Arbeit werden Antikörper gegen die RNA Basenmodifikationen m5C, m6A, Ψ und m26A präsentiert und charakterisiert. Verschiedene Anwendungen wie Immunfluoreszenz Tests und miCLIP (m6A Einzelnukleotid „cross-linking and immunoprecipitation“) Experimente sind denkbare Methoden, die neu generierten Antikörper zu verwenden. Die Daten von möglichen RIP-Seq Analysen (RNA-Immunopräzipitation und RNA-Sequenzierung) könnten auf Konsensus-Motive hinweisen, in welchen die Modifikationen hauptsächlich vorkommen. Derartige Sequenzen wären eine Möglichkeit, Proteine zu finden, die an Modifizierungen binden und letztendlich zu den holistischen Funktionen der verschiedenen modifizierten RNA-Basen führen. Solche unbekannten Basenmodifizierungs-bindende Proteine, oder kurz “Lese” Proteine zu entdecken war ein weiteres Ziel dieser Arbeit. Dafür wurde eine, von Kollegen entwickelte Pulldown-Methode abgeändert und für diese Zwecke optimiert. RNA-Haarnadelstrukturen, die eine modifizierte Base enthalten, wurden verwendet, um Proteine zu präzipitieren und herauszuziehen. Diese wurden anschließend mittles Massenspektrometrie identifiziert.
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