| License: Creative Commons Attribution 4.0 (4MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-415947
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.41594
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Date: | 9 February 2021 |
| Referee: | Prof. Dr. Joachim Wegener |
| Date of exam: | 5 February 2020 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik > Bioanalytik und Biosensorik (Prof. Joachim Wegener) |
| Keywords: | Label frei, ECIS, SPR, GPCR |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 41594 |
Abstract (English)
Label-free cell-based assays are an important analytical tool in drug research today. Optical approaches based on evanescent fields (e.g. Surface Plasmon Resonance, SPR; Dynamic Mass Redistribution, DMR) and altering current based impedance analysis (Electric Cell substrate Impedance Sensing, ECIS) are the most widespread techniques. The aim of this thesis was to develop and establish a dual ...
Abstract (English)
Label-free cell-based assays are an important analytical tool in drug research today. Optical approaches based on evanescent fields (e.g. Surface Plasmon Resonance, SPR; Dynamic Mass Redistribution, DMR) and altering current based impedance analysis (Electric Cell substrate Impedance Sensing, ECIS) are the most widespread techniques. The aim of this thesis was to develop and establish a dual ECIS-SPR sensor for G-protein coupled receptor signal transduction analysis and to compare the readout with individual ECIS and DMR experiments. For this purpose two cell lines were selected as example, expressing the histamine hH1 and dopamine D2 receptor.
The first step in the thesis was the establishment of a reliable assay format for the dual ECIS SPR sensor. The development of a manual liquid handling procedure enabled reproducible signal patterns for the histamine H1 receptor stimulation of the model cell line U-373 MG.
Theoretical analysis of SPR and ECIS signals with respect to changes occurring on the subcellular level (cell-surface junctions versus cell-cell junctions) provided a stronger basis for the interpretation of the experimental signals recorded by optical (SPR and DMR) and impedimetric means (ECIS). The simulations led to the conclusion that specific entities of the cell body have more and some have minor individual influence for either of the two analytical readouts (ECIS and SPR). ECIS integrates over the entire cell body and was found to be more sensitive for changes in cell morphology and less sensitive for the distance between lower membrane and substrate for the conditions of this thesis. SPR is mainly sensitive to the area close to substrate surface and reports on changes close to the sensor surface. The results show the complementary of optical and electrochemical approaches and the potential to provide a better understanding about the changes on the subcellular level during GPCR stimulation.
Cell adhesion experiments illustrated this complementary nature of the data of the dual ECIS-SPR sensor. The dual ECIS-SPR sensor offered the exact overlay of the recorded signal patterns of both readouts and those were compared with the well-known changes occurring in the cell layer during cell attachment and spreading. Whereas the interpretation of ECIS time courses is highly dependent on the AC frequency used for the measurement, interpretation of SPR time courses is dependent on the SPR parameter that is used to describe the experiment.
The cell line U-373 MG with the histamine H1 receptor was used for setting up the experimental procedures and training the system. With the dual ECIS-SPR sensor dose dependent receptor stimulation was found for the hH1 receptor expressed by U-373 MG cells when histamine was used as an agonist. Due to the time consuming experiments with the two chamber dual ECIS SPR sensor, successive agonist addition was applied. Successive agonist addition provided a higher throughput and similar EC50 values compared to the single dose dependency experiments. The next step was to use a synthetic agonist for the histamine H1 receptor. U-373 MG cells were stimulated with UR-KUM 530. Dose dependency was demonstrated revealing a higher potency compared to histamine. The dual ECIS-SPR sensor was not capable to provide different signal pattern for the different agonists (histamine, UR-KUM 530) and readings do not unequivocally support the notion that UR-KUM 530 behaves like a superagonist.
Based on the well-accepted coupling scheme activation of the hH1 receptor expressed by U-373 MG cells is presumably followed by a massive increase of Ca2+ within the cell. The ionophor Calcimycin increases artificially the Ca2+ concentration in the cytosol without involvement of a receptor and it provides similar signal patterns as histamine activation. This similarity in response profiles supports the role of Ca2+ as a second messenger in histamine signalling after hH1 receptor activation. In addition, the histamine-induced increase in Ca2+ levels was artificially blocked in U 373 MG cells by pre-incubation with the intracellular Ca2+ chelator BAPTA-AM. The BAPTA-AM pre-treatment provided distinguishable signal patterns after histamine stimulation. The main signal pattern part was blocked compared to the untreated experiments. The results show the influence of Ca2+ as second messenger for the signal pattern. These experimental series confirms the assumption that Ca2+ is the main second messenger dominating the recorded signal patterns received by a standard U-373 MG hH1 receptor stimulation.
Label-free monitoring of hH1 receptor stimulation was furthermore studied at different experimental temperatures. Experiments clearly demonstrated the temperature dependence of receptor-mediated signalling.
Another major subject of this thesis was the stimulation of the D2 receptor heterologous expressed in two isoforms (D2S and D2L subtype) in CHO cells. The D2 receptor activates the Gαi pathway which inhibits the adenylyl cyclase. Forskolin is an adenylyl cyclase activator and was used as pharmaceutical tool to confirm the signalling also by label-free means. The two receptor isoforms were first investigated using standard ECIS and DMR (EnSpire) devices providing distinguishable signal patterns for the isoforms. The investigation of the two isoforms with the dual ECIS-SPR sensor provided an exact comparison of the fingerprint-like time-resolved response profiles. The plot from the dual ECIS-SPR sensor offers precisely repeatable fingerprint like signal patterns. The two optical methods (SPR and DMR) show similar tendencies but the dual ECIS-SPR sensor is capable of a more precisely recording for the cell answer and provides therefore additional analytical benefits.
The ECIS-SPR sensor offers high time resolution and online monitoring capabilities for both analytical methods from a single cell layer which proved its usefulness in receptor-mediated signal transduction in this thesis. The high time resolution of both readouts allows for precise kinetic analysis immediately after receptor stimulation. The whole signal transduction cascade is covered analytically and offers a precise look on the cell response. This thesis showed that recording of fingerprint-like signal patterns for cells with different GPCR receptor types is possible with the dual ECIS-SPR sensor.
Translation of the abstract (German)
Markierungsfreie zellbasierte Assays sind heutzutage ein wichtiges analytisches Instrument in der Arzneimittelforschung. Optische Methoden die auf evaneszenten Feldern basieren (z. B. Oberflächenplasmonresonanz, SPR, dynamische Massenumverteilung, DMR) und Wechseltromwiederstand basierte Impedanzmessung (Electric Cell-Substrate Impedance Sensing, ECIS) sind die am weitesten verbreiteten ...
Translation of the abstract (German)
Markierungsfreie zellbasierte Assays sind heutzutage ein wichtiges analytisches Instrument in der Arzneimittelforschung. Optische Methoden die auf evaneszenten Feldern basieren (z. B. Oberflächenplasmonresonanz, SPR, dynamische Massenumverteilung, DMR) und Wechseltromwiederstand basierte Impedanzmessung (Electric Cell-Substrate Impedance Sensing, ECIS) sind die am weitesten verbreiteten Techniken. Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und Etablierung eines dualen ECIS-SPR Sensors zur Untersuchung von G-Protein-gekoppelter Rezeptor Signaltransduktion und der Vergleich der Messmethode mit individuellen ECIS und DMR Experimenten. Zu diesem Zweck wurden beispielhaft zwei Zelllinien ausgewählt die jeweils den Histamin hH1 beziehungsweise den Dopamin D2 Rezeptor exprimieren.
Der erste Schritt der Arbeit bestand in der Etablierung eines zuverlässigen Assay Formats für den dualen ECIS-SPR Sensor. Die Entwicklung einer manuellen Zugabe Methode ergab reproduzierbare Signal Muster für die Histamin H1 Rezeptor Stimulation der Modellzelllinie U 373 MG.
Die theoretische Analyse von SPR und ECIS Signalen in Bezug auf Änderungen auf subzellulärer Ebene (Zell-Oberflächen Kontaktstellen gegenüber Zell-Zell Kontaktstellen) lieferte eine stärkere Grundlage für die Interpretation der experimentellen Signale, aufgezeichnet mit optischen (SPR und DMR) und impedimetrischen Instrumenten (ECIS). Die Simulationen führten zu dem Schluss dass bestimmte Regionen des Zellkörpers mehr und einige einen geringen individuellen Einfluss auf eine der beiden analytischen Messmethoden (ECIS und SPR) haben. ECIS integriert über den gesamten Zellkörper und zeigte sich sensitiv für Veränderungen der Zellmorphologie und weniger empfindlich für den Abstand zwischen unterer Membran und Substrat für die verwendeten Bedingungen in dieser Arbeit. SPR ist vor allem sensitiv für den Bereich nahe der Substratoberfläche und reagiert auf Veränderungen direkt an der Sensoroberfläche. Die Ergebnisse zeigen die Komplementarität der optischen und elektrochemischen Ansätze und das Potenzial ein besseres Verständnis zu vermitteln für die Änderungen auf subzellulärer Ebene während der GPCR Stimulation.
Zell Adhäsion Experimente veranschaulichten die komplementäre Natur der Daten des dualen ECIS-SPR Sensors. Der duale ECIS-SPR Sensor ermöglichte die exakte Überlagerung der aufgezeichneten Signalmuster für beide Messmethoden, diese wurden verglichen mit den bekannten Veränderungen der Zellschicht während der Zell Bindung und Spreitung. Während die Interpretation der ECIS Zeitverläufe stark von der verwendeten Wechselstromfrequenz für die Messung abhängt ist die Interpretation der SPR Zeitverläufe von den SPR Parametern abhängig die zur Wiedergabe des Experiments verwendet wurden.
Die Zelllinie U-373 MG mit dem Histamin H1 Rezeptor wurde zum Einstellen des experimentellen Verfahrens und zum Training des Systems verwendet. Mit dem dualen ECIS SPR Sensor konnte eine Dosis-Wirkungsbeziehung gezeigt werden für den hH1 Rezeptor exprimiert von U-373 MG Zellen mit Histamin als Agonist. Aufgrund der zeitaufwendigen Experimente für den dualen ECIS-SPR Sensor mit einem zwei Messkammer System wurde eine sukzessive Agonisten Zugabe angewendet. Sukzessive Zugabe des Agonisten ergab einen höheren Durchsatz und ähnliche EC50 Werte im Vergleich zu den Dosis Abhängigen einzel Zugabe Experimenten. Der nächste Schritt war die Verwendung eines synthetischen Agonisten für den Histamin H1 Rezeptor. U-373 MG Zellen wurden mit UR-KUM 530 stimuliert. Es wurde eine Dosis Wirkungsbeziehung gezeigt die eine höhere Wirksamkeit zeigte im Vergleich zu Histamin. Der duale ECIS-SPR Sensor war nicht geeignet unterschiedliche Signalmuster für die verschiedenen Agonisten (Histamin, UR-KUM 530) zu liefern und die Messwerte unterstützen nicht eindeutig die Auffassung dass sich UR-KUM 530 wie ein Superagonist verhält.
Basierend auf dem allgemein akzeptierten Kopplungsschema für die Aktivierung des hH1 Rezeptors exprimiert in U-373 MG Zellen folgt wahrscheinlich ein massiver Anstieg der Ca2 + konzentration innerhalb der Zelle. Der Ionophor Calcimycin erhöht künstlich die Ca2+ konzentration im Cytosol ohne Beteiligung eines Rezeptors und liefert ähnliche Signalmuster wie durch Histamin Aktivierung. Die Ähnlichkeit in den Antwortprofilen unterstützt die Rolle von Ca2 + als sekundärem Botenstoff bei der Histamin Signalweiterleitung nach hH1 Rezeptor Aktivierung. Zusätzlich wurde der Histamin induzierte Anstieg des Ca2 + Spiegels in U-373 MG Zellen durch Vorinkubation mit dem intrazellulären Ca2+ Chelator BAPTA-AM künstlich blockiert. Die BAPTA-AM Vorbehandlung ergab nach Histamin Stimulation unterscheidbare Signalmuster. Der Hauptteil des Signals war im Vergleich zu den unbehandelten Experimenten blockiert. Die Ergebnisse zeigen den Einfluss von Ca2 + als sekundärer Botenstoff auf das Signalmuster. Diese Versuchsreihen bestätigen die Annahme dass Ca2 + der wichtigste sekundäre Botenstoff ist, welcher die aufgezeichneten Signalmuster dominiert, die bei einer Standard U-373 MG hH1 Rezeptorstimulation aufgezeichnet werden.
Das markierungsfreie Messen der hH1 Rezeptor Stimulation wurde ferner bei unterschiedlichen Temperaturen experimentell untersucht. Die Experimente zeigten deutlich die Temperaturabhängigkeit der Rezeptor vermittelten Signalübertragung.
Ein weiteres zentrales Thema dieser Arbeit war die Stimulierung des D2 Rezeptors welcher heterolog exprimiert wird als zwei Isoformen (D2S und D2L Subtyp) in CHO Zellen. Der D2 Rezeptor aktiviert den Gαi Signalweg welcher die Adenylylcyclase hemmt. Forskolin ist ein Adenylylcyclase Aktivator und wurde als pharmazeutisches Werkzeug verwendet um die Signalübertragung mit markierungsfreien Methoden zu bestätigen. Die beiden Rezeptor Isoformen wurden zunächst mit Standard ECIS und DMR (EnSpire) Geräten untersucht welche unterscheidbare Signalmuster für die beiden Isoformen ergaben. Die Untersuchung der beiden Isoformen mit dem dualen ECIS-SPR Sensor bietet einen exakten Vergleich der fingerabdruckähnlichen zeitaufgelösten Antwortprofile. Das Diagramm des dualen ECIS-SPR Sensors bietet präzise reproduzierbare Fingerabdruck ähnliche Signalmuster. Die beiden optischen Methoden (SPR und DMR) zeigen ähnliche Tendenzen aber der duale ECIS-SPR Sensor kann die Zellantwort präziser aufzeichnen und bietet daher zusätzliche analytische Vorteile.
Der ECIS-SPR Sensor bietet eine hohe Zeitauflösung und online Messung für beide Analysemethoden aus einer einzelnen Zellschicht was sich in dieser Arbeit als nützlich für die rezeptorvermittelte Signalübertragung erwiesen hat. Die hohe zeitliche Auflösung für beide Messmethoden ermöglicht eine präzise kinetische Analyse unmittelbar nach der Rezeptorstimulation. Die gesamte signalweiterleitungs Kaskade wird analytisch erfasst und bietet einen präzisen Blick auf die Zellantwort. Diese Arbeit zeigte dass mit dem dualen ECIS SPR Sensor die Aufnahme fingerabdruckartiger Signalmuster für Zellen mit unterschiedlichen GPCR Rezeptortypen möglich ist.
Metadata last modified: 10 Feb 2021 08:00
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