Gene therapy is the delivery of therapeutic nucleic acids into a patient’s cells in order to prevent or treat genetic disorders or acquired diseases. This is usually achieved by using a gene delivery system as “naked” nucleic acids face many biological barriers on their way to and within the target cells. Most therapies currently on the market are based on viral vectors but due to a number of ...
Zusammenfassung (Englisch)
Gene therapy is the delivery of therapeutic nucleic acids into a patient’s cells in order to prevent or treat genetic disorders or acquired diseases. This is usually achieved by using a gene delivery system as “naked” nucleic acids face many biological barriers on their way to and within the target cells. Most therapies currently on the market are based on viral vectors but due to a number of significant disadvantages, interest has shifted to non-viral alternatives like polycations. These polymers are currently the subject of intense research, partly due to their chemical diversity, shelf stability, and diverse architecture. Polyethylenimine (PEI) is often considered to be the gold standard for transfection but suffers from the fact that its transfection efficiency, as well as cytotoxicity, increase with molecular weight. One method to overcome this correlation is to cross-link less toxic, low molecular weight linear PEIs to higher molecular weight branched PEIs with increased transfection efficiency, with reduction sensitive, biodegradable cross-linkers based on disulfides.
Numerous studies have demonstrated that the presence of disulfides in polycationic carriers has a favorable influence on many aspects of the gene delivery process. In some cases, however, the presence of disulfides has been shown to have the opposite effect and it is often not well understood why. In fact, many aspects of the delivery are not well understood, partly due to the lack of suitable tools to investigate the delivery process and the carrier degradation.
The main goal of this thesis is the development and characterization of new fluorescence-based analytical tools that allow for new insights into the interaction between polycations and nucleic acids, as well as cellular uptake, trafficking, and processing of reduction sensitive polyplexes. This was achieved, among other things, by (1) developing a novel, straightforward method for labeling polyamines with a wide variety of fluorescent probes, including a redox sensitive dye, (2) thoroughly investigating the photophysical and chemical properties of polymer bound fluorophores and fluorescently labeled polycations in complex with nucleic acids, and (3) by using these polycations to study polymer/nucleic acid interactions and (4) the cleavage and intracellular trafficking of reduction sensitive polyplexes.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Gentherapie ist das Einbringen von therapeutischen Nukleinsäuren in die Zellen eines Patienten, um den Ausbruch genetischer oder erworbener Krankheiten zu verhindern oder um diese zu behandeln. Das Einbringen wird in der Regel mit Hilfe eines Gene Delivery Systems erreicht, da "nackte" Nukleinsäuren auf ihrem Weg zu den Zielzellen auf viele biologische Barrieren stoßen. Die meisten Therapien, die ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Gentherapie ist das Einbringen von therapeutischen Nukleinsäuren in die Zellen eines Patienten, um den Ausbruch genetischer oder erworbener Krankheiten zu verhindern oder um diese zu behandeln. Das Einbringen wird in der Regel mit Hilfe eines Gene Delivery Systems erreicht, da "nackte" Nukleinsäuren auf ihrem Weg zu den Zielzellen auf viele biologische Barrieren stoßen. Die meisten Therapien, die derzeit auf dem Markt sind, basieren auf viralen Vektoren. Diese Vektoren haben aber eine Reihe erheblicher Nachteile und so hat sich das Interesse auf nicht-virale Alternativen wie Polykationen verlagert. Diese Polymere sind derzeit Gegenstand intensiver Forschung, was zum Teil auf ihre chemische Vielfalt, ihre Lagerstabilität und ihre vielfältige Architektur zurückzuführen ist. Polyethylenimin (PEI) wird oft als der Goldstandard für die Transfektion angesehen. Seine Transfektionseffizienz nimmt mit dem Molekulargewicht zu; leider auch seine Zytotoxizität. Eine Methode zur Überwindung dieser Korrelation ist die Vernetzung von weniger toxischen, niedermolekularen, linearen PEIs zu höhermolekularen, verzweigten PEIs mit erhöhter Transfektionseffizienz. Zur Vernetzung können reduktionsempfindliche, bioabbaubare Cross-Linker auf Basis von Disulfiden verwendet werden.
Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass das Vorhandensein von Disulfiden in polykationischen Gene Carriern einen günstigen Einfluss auf viele Aspekte des Gene-Delivery-Prozesses hat. In einigen Fällen hat sich jedoch auch der gegenteilige Effekt gezeigt und es ist oft nicht gut verstanden, warum. Tatsächlich sind viele Aspekte dieses Gene-Deliverys nicht gut verstanden, teilweise aufgrund des Mangels an geeigneten Werkzeugen zur Untersuchung des Delivery-Prozesses und des Carrierabbaus.
Das Hauptziel dieser Arbeit ist die Entwicklung und Charakterisierung neuer fluoreszenzbasierter analytischer Werkzeuge, die neue Einblicke in die Interaktion zwischen Polykationen und Nukleinsäuren sowie in die zelluläre Aufnahme, des Traffickings und die intrazelluläre Prozessierung reduktionsempfindlicher Polyplexe ermöglichen. Dies wurde u. a. erreicht durch (1) die Entwicklung einer neuartigen, einfachen Methode zur Markierung von Polyaminen mit einer Vielzahl von Fluoreszenzsonden, einschließlich eines redoxempfindlichen Farbstoffs, (2) die gründliche Untersuchung der photophysikalischen und chemischen Eigenschaften von polymergebundenen Fluorophoren und fluoreszenzmarkierten Polykationen im Komplex mit Nukleinsäuren und (3) die Verwendung dieser Polykationen zur Untersuchung von Polymer/Nukleinsäure-Interaktionen und (4) die Spaltung und des intrazellulären Traffickings von reduktionsempfindlichen Polyplexen.
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