| Lizenz: Creative Commons Namensnennung 4.0 International (19MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-431760
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.43176
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 18 Mai 2021 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Christoph Klein |
| Tag der Prüfung: | 11 Mai 2020 |
| Institutionen: | Medizin > Lehrstuhl für experimentelle Medizin und Therapieverfahren |
| Stichwörter / Keywords: | Brustkrebs, Metastasierung, disseminierte Krebszellen, Luminal B, breast cancer, metastasis, disseminated cancer cells, luminal B |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 43176 |
Zusammenfassung (Englisch)
Breast cancer (BC) accounts for almost a quarter of reported cancer incidences in women worldwide. It comprises several molecular subtypes, out of which the luminal A (LumA) and luminal B (LumB) types are the most common. Despite being quite similar from a histopathological point of view, the LumB type has a far worse prognosis due to a higher propensity to metastasize and develop therapy ...
Zusammenfassung (Englisch)
Breast cancer (BC) accounts for almost a quarter of reported cancer incidences in women worldwide. It comprises several molecular subtypes, out of which the luminal A (LumA) and luminal B (LumB) types are the most common. Despite being quite similar from a histopathological point of view, the LumB type has a far worse prognosis due to a higher propensity to metastasize and develop therapy resistance. Despite decades of effort, metastasis is still responsible for ~90 % of cancer-related deaths. Metastatic relapse is caused by disseminated cancer cells (DCC) that can lie dormant in distant organs for several years before growing into macrometastases. The epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) can be used as a marker to detect DCCs in patient bone marrow (BM). However, there are non-cancer cells (NCC) belonging to the erythroid progenitor lineage in the BM, which also express this marker, thereby representing a confounding factor in our EpCAM+ single cell collective. Regarding treatment resistance, recent studies have implicated several miRNAs in resistance of BC to the most common systemic treatments.
The aim of this dissertation was (1) to identify a way to distinguish true DCCs from NCCs, (2) to identify genomic or transcriptomic differences between LumA and LumB DCCs accounting for LumB’s increased malignancy, and (3) to develop a novel extended whole transcriptome amplification (eWTA) to isolate miRNAs along with mRNA and gDNA from single cells to further elucidate the underlying causes for LumB BC’s higher aggressiveness.
The data revealed that separation of NCCs from true DCCs was possible using an M0 DCC qPCR signature consisting of four genes, but the distinction was most reliably done using copy number alteration (CNA) profiling. However, the data suggested that the qPCR signature might actually be more precise that the CNA profiling. A detailed analysis of the CNA profiles of true DCCs revealed no differences between LumA and LumB DCCs. Additionally, targeted proliferation marker analyses by qPCR did not reveal differences between LumA and LumB DCCs, neither regarding expression levels nor regarding the percentage of proliferating cells. In contrast to the comparison of LumA and LumB DCCs, there was a pronounced divergence of CNAs in DCCs derived from non-metastatic (M0) and metastatic (M1) BC patients with the latter carrying more genomic aberrations compared to the former. In line with the CNA profiles, targeted proliferation marker analyses showed a difference between M0 and M1 DCCs with the M1 DCCs displaying a lower percentage of proliferating cells. Interestingly, qPCR revealed that half of M0 cells were proliferating. However, there was no correlation between the KI67 status of the primary tumor (PT) and the expression of MKI67 in matched DCCs.
Subsequent global transcriptomic profiling by RNA-Sequencing confirmed that all of the DCCs, which were classified as proliferating by qPCR, were expressing cell cycle-associated genes significantly more than the non-proliferating DCCs. Unsupervised hierarchical clustering identified two subgroups among the proliferating DCCs with differing expression of analyzed genes. These groups comprised either a mix of DCCs from all subtypes, or almost exclusively LumB DCCs, suggesting a higher proliferation of LumB DCCs. The RNA-Seq analysis also uncovered a correlation of the overall expression signature of DCCs with the KI67 status of the PT, which indirectly translated to differences between LumA and LumB subtypes in their overall gene expression. Gene ontology (GO) analysis identified several biological processes that were enriched among the up- and down-regulated genes in LumB compared to LumA. Genes related to membranes and transmembrane transport were associated with down-regulated genes, while splicing, ribosomes, and translation were overrepresented among the up-regulated genes. Cell adhesion and extracellular matrix (ECM) pathways were present in both gene lists, indicating a complex differential regulation of these processes in LumB compared to LumA.
In parallel to the previous experiments, a preliminary protocol for the novel eWTA was established. This protocol included a polyadenylation step to enable capture of single stranded RNAs. The polyadenylation required introduction of an additional dilution of the cell lysate, in order to prevent denaturation of the Poly(A) polymerase by the lysis buffer. Experiments on artificial long RNA as well as expression changes of ribosomal RNAs demonstrated that the employed polyadenylation strategy worked in principle. However, a detection of short RNAs in the range of miRNA could not be done, as this would have required development of a separate method compatible with our WTA adapters. Nevertheless, the first step towards an eWTA for isolation of the miRNAome alongside the genome and transcriptome of a single cell has been taken.
In conclusion, the data suggest that the main factors driving the increased malignancy of LumB cancer is likely a higher proliferation, because it enables faster accumulation of somatic mutations. Two hypothetical scenarios explaining the underlying mechanisms are the following: (1) LumB DCCs may interact with the microenvironment (ME) at metastatic target sites in a different manner than LumA DCCs, which leads to changes in mRNA splicing, which in turn increases proliferation. Or, (2) LumB DCCs may initially display differential mRNA splicing before arriving at the target site, causing altered interaction with the ME at the target site and in response proliferation is up-regulated in the DCCs. More research will be required to provide functional proof of the higher proliferation of LumB DCCs and to determine the exact mechanisms underlying this alleged higher proliferation profile of LumB DCCs. It is also possible that miRNAs are somehow involved in this. Therefore, it will be important to further develop the eWTA protocol, in order to aid in advancing our knowledge of the intricate crosstalk of miRNAs with their target mRNAs and concomitant genomic changes.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Brustkrebs (BC) ist weltweit für fast ein Viertel aller Krebserkrankungen in Frauen verantwortlich. BC setzt sich aus mehreren molekularen Subtypen zusammen, von denen luminal A (LumA) und luminal B (LumB) die häufigsten sind. Trotz der starken histopathologischen Ähnlichkeit dieser Subtypen ist die Prognose bei LumB Patientinnen weitaus schlechter, was auf eine höhere Tendenz zur Metastasierung ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Brustkrebs (BC) ist weltweit für fast ein Viertel aller Krebserkrankungen in Frauen verantwortlich. BC setzt sich aus mehreren molekularen Subtypen zusammen, von denen luminal A (LumA) und luminal B (LumB) die häufigsten sind. Trotz der starken histopathologischen Ähnlichkeit dieser Subtypen ist die Prognose bei LumB Patientinnen weitaus schlechter, was auf eine höhere Tendenz zur Metastasierung und Entwicklung von Therapieresistenzen zurückzuführen ist. Trotz jahrzehntelanger Anstrengungen verursachen Metastasen immer noch ~90 % aller krebsbedingten Todesfälle. Metastatische Rezidive werden von disseminierten Krebszellen (DCC), die zunächst in entfernten Organen schlummern bevor sie zu Makrometastasen anwachsen, verursacht. Zur Detektion von DCC im Knochenmark (BM) von Patienten kann das epitheliale Zelladhäsionsmolekül (EpCAM) als Erkennungsmerkmal verwendet werden. Jedoch existiert im BM auch eine EpCAM-exprimierende Population von nicht-Krebszellen (NCC), die zur Abstammungslinie der erythroiden Vorläuferzellen gehört und somit unser Zellkollektiv verunreinigt. Bezüglich der Therapieresistent konnten Studien kürzlich nachweisen, dass miRNAs an der Entwicklung von Resistenzen gegen viele systemische Standardbehandlungsmethoden beteiligt sind.
Das Ziel dieser Dissertation war es (1) echte DCCs von NCCs zu unterscheiden, (2) genomische oder transkriptomische Unterschiede zwischen LumA und LumB DCCs, die für die höhere Malignität von LumB verantwortlich sind, zu identifizieren und (3) eine erweiterte globale Transkriptomamplifikation (eWTA) zu entwickeln, die die gemeinsame Isolation von miRNA, mRNA und gDNA aus einzelnen Zellen ermöglicht. Diese neue Methode sollte einen detaillierteren Einblick in die zugrundeliegenden Ursachen der höheren Aggressivität von LumB BC gewähren.
Die Daten zeigten, dass eine Unterscheidung von NCCs und echten DCCs durch eine aus vier Genen bestehende M0 DCC Signatur mittels qPCR möglich war, eindeutige Ergebnisse jedoch nur durch die Analyse von Kopienzahlveränderungen (CNA) im Genom erzielt werden konnten. Allerdings wiesen die Daten darauf hin, dass die qPCR Signatur eventuell sogar genauer sein könnte als die CNA-Analyse. Eine tiefergehende CNA-Analyse der echten DCCs förderte keine signifikanten Unterschiede zwischen LumA und LumB zutage. Außerdem ergab eine gezielte Analyse von Proliferationsmarkern mittels qPCR ebenfalls keine Unterschiede zwischen den beiden Subtypen, weder im Expressionsniveau noch in der Expressionsfrequenz. Im Gegensatz dazu fanden sich in DCCs von nicht-metastatischen (M0) Patientinnen insgesamt weit weniger CNAs als in DCCs von metastatischen (M1) Patientinnen. Analog dazu ergab die gezielte Analyse von Proliferationsmarkern eine weitaus niedrigere Frequenz proliferierender Zellen in der Gruppe der M1 DCCs im Vergleich zu den M0 DCCs. Interessanterweise zeigte die qPCR, dass die Hälfte der M0 Zellen proliferierte und es keine Korrelation zwischen dem KI67 Status des Primärtumors (PT) und der Expression von MKI67 in den gepaarten DCCs gab.
Eine nachfolgende globale Transkriptomanalyse mittels RNA-Sequenzierung bestätigte, dass alle DCCs, welche zuvor mittels qPCR als proliferierend klassifiziert wurden, eine Vielzahl von Zellzyklus-assoziierten Genen signifikant stärker exprimierten als nicht-proliferierende DCCs. Eine unbeaufsichtigte Clustering-Analyse identifizierte innerhalb der proliferierenden DCCs zwei Untergruppen mit unterschiedlicher Expressionsstärke der betrachteten Gene. Diese Gruppen bestanden entweder aus einer Mischung von DCCs aller BC Subtypen oder beinahe ausschließlich aus LumB DCCs, was auf eine höhere Proliferationsaktivität der LumB DCCs hindeutete. Die Sequenzierungsdaten enthüllten außerdem eine Korrelation der Gesamtexpressionsprofile der DCCs mit dem KI67 Status der gepaarten PTs, was indirekt Unterschiede zwischen LumA und LumB Subtypen in ihren Gesamtexpressionsprofilen bedeutete. Eine Genontologie-Analyse enthüllte mehrere biologische Prozesse, die unter den hoch- und herunter-regulierten Genen in LumB im Vergleich zu LumA DCCs angereichert waren. Gene, die allgemein mit Membranen und Transmembrantransport assoziiert sind, fanden sich unter den herunterregulierten Genen, während Splicing, Ribosomen und Translation unter den hochregulierten Genen überrepräsentiert waren. Gene, die in Verbindung mit Zelladhäsion und der extrazellulären Matrix (ECM) stehen, kamen sowohl in den herunter- als auch den hochregulierten Genen vor, was auf eine komplexe differenzielle Regulation dieser Prozesse in LumB im Vergleich zu LumA DCCs hindeutet.
Parallel zu den beschriebenen Experimenten wurde ein vorläufiges Protokoll für die neue eWTA etabliert. Hierzu wurde eine Polyadenylierung in das Protokoll eingefügt, welche das Einfangen einzelsträngiger RNAs ermöglichen sollte. Die Polyadenylierung wurde durch die zusätzliche Einführung einer Verdünnung des Zelllysats ermöglicht, um eine Inaktivierung der Poly(A) Polymerase durch den Lysepuffer zu verhindern. Experimente mit einer künstlichen, langen RNA sowie Expressionsveränderungen endogener ribosomaler RNAs zeigten, dass die angewandte Polyadenylierungsstrategie prinzipiell funktionierte. Jedoch steht ein Funktionsnachweis an kurzen RNAs, ähnlich der Länge der miRNAs, noch aus, da solch ein Nachweis die Entwicklung einer separaten Methode zur Messung dieser RNAs erfordert hätte, da existierende Methoden nicht mit unseren WTA Adaptoren kompatibel sind. Nichtsdestotrotz stellt die vorläufige eWTA einen ersten Schritt in Richtung der Isolation des miRNAoms zusammen mit Genom und Transkriptom von Einzelzellen dar.
Zusammengenommen legen die Daten dieser Studie nahe, dass der Hauptfaktor für die höhere Malignität von LumB BC vermutlich eine höhere Proliferationsrate ist, da diese eine zügigere Anhäufung von somatischen Mutationen ermöglicht. Anhand der Daten sind zwei hypothetische Szenarien, die zu dieser höheren Proliferationsrate führen, denkbar: (1) LumB DCCs könnten anders auf die Mikroumgebung in metastatischen Zielorganen reagieren als LumA DCCs, wodurch zunächst Veränderungen im mRNA Splicing induziert werden, was dann schließlich zu einer erhöhten Proliferation führt. (2) Alternativ könnten LumB DCCS sich bereits vor ihrer Ankunft im Zielorgan in einem unterschiedlichen Splicing-Zustand befinden, wodurch sie anders mit der Mikroumgebung interagieren und als Antwort darauf stärker proliferieren als LumA DCCs. Es bedarf jedoch weiterer Forschungsarbeiten, um die exakten zugrundeliegenden Mechanismen der mutmaßlich stärkeren Proliferation von LumB DCCs zu bestimmen. Es ist durchaus denkbar, dass miRNAs zumindest teilweise daran beteiligt sind, weshalb es wichtig sein wird das vorläufige eWTA Protokoll weiter zu entwickeln, um ein tiefgreifendes Verständnis der feinen Interaktionen von miRNAs mit ihren Zieltranskripten und einhergehenden genomischen Veränderungen zu ermöglichen.
Metadaten zuletzt geändert: 19 Mai 2021 06:51
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