| Lizenz: Creative Commons Namensnennung 4.0 International (5MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-432196
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.43219
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 10 Juni 2020 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Peter Oefner |
| Tag der Prüfung: | 13 Dezember 2019 |
| Institutionen: | Medizin > Institut für Funktionelle Genomik > Lehrstuhl für Funktionelle Genomik (Prof. Oefner) |
| Stichwörter / Keywords: | Urin, Metabolomics, Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 540 Chemie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 43219 |
Zusammenfassung (Englisch)
With recent instrumental improvements, untargeted high-resolution liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) has been increasingly applied to the analysis of complex biological matrices such as urine. The latter is a preferred matrix in large scale metabolomics studies, because it can be obtained non-invasively in sufficient quantities. However, the widely varying concentrations of urine ...
Zusammenfassung (Englisch)
With recent instrumental improvements, untargeted high-resolution liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) has been increasingly applied to the analysis of complex biological matrices such as urine. The latter is a preferred matrix in large scale metabolomics studies, because it can be obtained non-invasively in sufficient quantities. However, the widely varying concentrations of urine metabolites, mostly due to different fluid intake, pose analytical challenges, such as ion suppression, detector saturation, column overload or failure to detect low abundant metabolites. In this doctoral thesis, both targeted and untargeted analysis of urine by LC-MS was investigated to address some of these challenges. Further, the question was addressed if untargeted fingerprinting of urine specimens is adequate for the quantitative analysis of these specimens.
First, five different dilution and normalization strategies of spot urinary speci-mens were compared. Specimens were adjusted either to a uniform creatinine concentration or osmolality without any further normalization of the acquired data, or they were uniformly diluted and post-acquisition normalized to creatinine, osmolality, or sum of all integrals. Spot urine specimens from both an apparently healthy cohort and two different cohorts suffering from chronic kidney disease (CKD) were investigated to test the effect of the various strategies on sample classification. The advantages of pre-acquisition dilution of urine to a fixed creatinine concentration in the acquisition of metabolite fingerprints by LC coupled to a high resolution time-of-flight mass spectrometer (LC-HRTOFMS) were demonstrated. These included the absence of significant correlations of missing values with either the original urine creatinine concentration (r = 0.216, p = 0.133) or osmolality (r = - 0.074, p = 0.608). Moreover, pre-acquisition dilution to a uniform creatinine concentration was the only method to correctly assign urine specimens of controls (national cohort, NC) and CKD patients to their respective clusters in hierarchical cluster analysis, while the other dilution and normalization methods yielded indistinct clusters. Therefore, time and labor associated with pre-acquisition dilution to a uniform creatinine concentration are more than justified.
Next, a targeted liquid chromatography triple quadrupole mass spectrometry (LC-QqQMS) method for the quantification of urine metabolites associated with CKD was developed. Some of these metabolites had been identified during the testing of different pre-acquisition dilution and normalization strategies. The dynamic range of the method showed adequate sensitivity for all urine metabolites investigated. The lower limits of quantification (LLOQs) ranged between 0.04 nM to 11 nM except for creatinine (CRE), creatine (CRT), hypoxanthine (HX) and xanthurenic acid (XA), which featured LLOQs of 65.9 nM, 700 nM, 87.8 nM, and 22.0 nM, respectively. Spike-in experiments yielded recoveries of 86% to 121%. The method was applied successfully to the determination CRE, C-mannosyltryptophan (CMT) and pseudouridine (PSU) in urine (Sekula et al. 2017, Scientific Reports 7(1): 17400) and to CRE and CRT in plasma (Wallmeier et al. 2017, Journal of Proteome Research 16(4): 1784-1796).
Finally, targeted and untargeted measurements of urine specimens were compared with respect to the quantitative performance of untargeted measurements. Combining both targeted and untargeted analysis of urine in a single analysis would constitute a tremendous saving of time and resources. First, calibration curves of selected metabolites were compared, measured in both full scan and MRM mode on a Bruker Maxis Impact quadrupole time-of-flight and a Sciex 4000 QTRAP mass spectrometer, respectively. The LLOQs on the former instrument ranged from 5.49 nM to 1730 nM, whereas the corresponding range on the latter instrument was 1.37 nM to 65.9 nM. The linear ranges were also narrower for the untargeted than the targeted method. Reproducibility over the linear range compared well to the targeted approach. All relative standard deviation (RSD) values for the selected metabolites were below 10%. Next, targeted and untargeted measurements of 200 CKD and 100 non-CKD urine specimens were compared to examine the quantitative performance of the untargeted platform. For the CKD samples, targeted and untargeted measurements of PSU, XA, CMT and tryptophan (TRP) yielded Spearman’s rank correlation coefficients ranging from 0.67 to 0.87, while the corresponding coefficients for urine specimens from apparently healthy individuals ranged from 0.73 to 0.95. PSU yielded consistently the weakest correlation coefficient, most likely due to matrix effects as a consequence of its low retention and, thus, co-elution with many other analytes. It is concluded, that the correlation of quantitative data gained by targeted and non-targeted analysis depends on the instruments and methods used as well as the metabolites and their abundance.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Auf Grund von instrumentellen Verbesserungen hat die hochauflösende, nicht zielgerichtete Flüssigchromatographie - Massenspektrometrie (LC-MS Finger-printing-Analyse) rasant an Bedeutung in der Analyse von komplexen biologi-schen Matrices wie Urin gewonnen. Urin ist eine sehr interessante Proben-matrix für große Kohorten-Studien, da sie nicht invasiv und in ausreichenden Mengen gesammelt werden ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Auf Grund von instrumentellen Verbesserungen hat die hochauflösende, nicht zielgerichtete Flüssigchromatographie - Massenspektrometrie (LC-MS Finger-printing-Analyse) rasant an Bedeutung in der Analyse von komplexen biologi-schen Matrices wie Urin gewonnen. Urin ist eine sehr interessante Proben-matrix für große Kohorten-Studien, da sie nicht invasiv und in ausreichenden Mengen gesammelt werden kann. Allerdings birgt die Analyse von Urin auch viele Herausforderungen. Die stark variierenden Konzentrationen an Metaboliten, die unter anderem aus unterschiedlicher Flüssigkeitsaufnahme resultieren, führen zum Beispiel zu Ionenunterdrückung, Detektorsättigung, Überladung der Säule oder dem Unvermögen, niedrig abundante Metaboliten zu detektieren. In dieser Doktorarbeit wurden sowohl die zielgerichtete als auch die nicht zielgerichtete Analyse von Urinproben mittels LC-MS untersucht, um einige dieser Herausforderungen zu adressieren. Außerdem wurde der Frage nachgegangen, ob eine nicht zielgerichtete Analyse von Urinproben die gezielte quantitative Analyse von Metaboliten im Urin ersetzen kann.
Zuerst wurden fünf Verdünnungs- und Normalisierungsstrategien für die Analyse von Spontanurin mittels der LC gekoppelt an ein hochauflösendes Flugzeitmassenspektrometer (LC-HRTOFMS) verglichen. Die Proben wurden entweder auf eine konstante Kreatinin-Konzentration beziehungsweise Osmolalität eingestellt, ohne anschließende Normalisierung der aufgenommenen Daten, oder wie es die übliche Praxis ist, einheitlich verdünnt und nach der Messung wurden die Daten auf Kreatinin, Osmolalität oder die Summe über alle Integrale normalisiert. Dabei wurde der Effekt dieser verschiedenen Strategien auf die Probenklassifizierung getestet. Als Proben wurde Spontanurin von einer vermeintlich gesunden Kohorte (Nationale Kohorte, NC) und von zwei verschiedenen Patientenkohorten, die unter chronischer Nierenerkrankung (CKD) litten, verwendet. Hierbei konnten die Vorteile der Verdünnung von Urin vor der Datenaufnahme auf eine konstante Kreatinin-Konzentration für einen metabolischen Fingerprint mittels LC-MS demonstriert werden. Nur die Proben, die auf eine konstante Kreatinin-Konzentration verdünnt wurden, zeigten weder eine Korrelation der Anzahl an fehlenden Messwerten mit der ursprünglichen Kreatinin-Konzentration (r = 0,216, p = 0,133) noch mit der Osmolalität (r = - 0,074, p = 0,608). Zudem erzielte diese Methode unter allen getesteten Vorgehensweisen prozentual die meisten signifikant diskriminierenden Features zwischen Patienten mit CKD und Kontrollen. Die zweitbeste Methode hinsichtlich der Prozentzahl an diskriminierenden Features war die konstante Verdünnung in Kombination mit der nachfolgenden Normalisierung auf die Summe aller Integrale. Die Überlegenheit der Verdünnung vor der Messung auf eine einheitliche Kreatinin-Konzentration wurde zusätzlich durch eine hierarchische Cluster-Analyse gezeigt. Diese konnte die Kontrollen und die CKD Patienten zuverlässig clustern. Im Gegensatz dazu erzielten die anderen Verdünnungs- und Normalisierungsmethoden keine einheitlichen Cluster. Deshalb kann die einheitliche Verdünnung (z.B. ¼) in Kombination mit der Normalisierung auf Kreatinin oder Osmolalität nicht empfohlen werden. Die Auswirkungen der großen Varianz der Metabolit-Konzentration zwischen den Proben auf Ionenunterdrückung, Detektorsättigung und Überladung der Säule werden durch diese Normalisierungsmethoden nicht ausreichend erfasst. Darüber hinaus ermöglicht die vorgeschlagene Normalisierungsmethode die zuverlässige Probenklassifizierung, was anhand verschiedener Patienten-Kohorten gezeigt wurde. Außerdem konnten die meisten differenziellen Features, die CKD Patienten von vermeintlich gesunden Kontrollen unterschieden, bekannten Metaboliten zugeordnet werden. All diese Ergebnisse unterstreichen die überragende Reproduzierbarkeit und Anwend-barkeit der Verdünnung auf eine einheitliche Kreatinin-Konzentration vor der eigentlichen Messung und rechtfertigen den damit verbundenen Zeit- und Arbeitsaufwand.
Ein weiterer Fokus dieser Arbeit lag in der Weiterentwicklung einer LC-QqQMS basierten Methode, die ursprünglich von Zhu et al. (Analytical and Bioanalytical Chemistry 401: 3249-3261) für die Bestimmung von Tryptophanmetaboliten beschrieben worden war, für die gezielte Quantifizierung von insgesamt 33 Metaboliten im Urin, welche mit CKD in Verbindung gebracht werden. Der dynamische Bereich der weiterentwickelten Methode zeigte eine angemessene Nachweisempfindlichkeit für alle hinzugefügten Metaboliten in der Analyse von Urinproben. Die Bestimmungsgrenzen (LLOQs) lagen bei 0,04 nM bis 11 nM, außer für Kreatinin (CRE), Kreatin (CRT), Hypoxanthin (HX) und Xanthurensäure (XA), welche eine untere Bestimmungsgrenze von 65,9 nM, 700,0 nM, 87,8 nM bzw. 22,0 nM aufwiesen. Die in einem Spike-in Versuch ermittelten Wiederfindungsraten für einen Teil der in der Methode enthaltenen Metaboliten lagen zwischen 86% und 121%. Die Methode wurde erfolgreich für die Quantifizierung von Kreatinin, C-Mannosyltrptophan (CMT) und Pseudouridin (PSU) in Urin (Sekula et al. 2017, Scientific Reports 7(1): 17400) sowie von Kreatinin und Kreatin in Plasma (Wallmeier et al. 2017, Journal of Proteome Research 16(4): 1784-1796) verwendet.
Zuletzt wurden zielgerichtete und nicht zielgerichtete Messungen von Urinproben in Hinblick auf die quantitative Leistungsfähigkeit der nicht zielgerichteten Messungen verglichen. Es wäre ein enormer Vorteil, wenn nicht zielgerichtete Analysen einer Probe auch eine zuverlässige Quantifizierung der identifizierten Metaboliten erlauben würden. Dafür wurden zuerst die Kalibrationskurven von ausgewählten Metaboliten für die beiden Plattformen verglichen. Es wurde gezeigt, dass der lineare Bereich der beiden Plattformen gut übereinstimmt. Die unteren Bestimmungsgrenzen (LLOQ) lagen zwischen 5,49 nM und 1.730 nM, wohingegen jene für die gezielten Analysen mit 1,37 nM bis 65,9 nM erwartungsgemäß niedriger waren. Für alle ausgewählten Metaboliten waren die Größenordnungen der linearen Bereiche der nicht zielgerichteten Methode niedriger im Vergleich zur zielgerichteten Methode, wodurch die höhere Sensitivität der zielgerichteten Methode aufgezeigt wurde. Die Reproduzierbarkeit im linearen Bereich war mit relativen Standardabweichungen von <10% im Vergleich zur gezielten Herangehensweise sehr gut. Als nächstes wurden zielgerichtete und nicht zielgerichtete Messungen von 200 CKD und 100 nicht-CKD Urinproben verglichen, um die quantitative Leistungsfähigkeit der nicht zielgerichteten Plattform zu untersuchen. Die zielgerichteten und nicht zielgerichteten Messungen von PSU, CMT, XA und Tryptophan (TRP) in den CKD Urinproben zeigten eine gute Übereinstimmung mit Spearman‘schen Rangkorrelationskoeffizienten (SCC) von 0,67 bis 0,87. Für Proben gesunder Probanden wurde eine noch bessere Korrelation zwischen der zielgerichteten und nicht zielgerichteten Plattform festgestellt; die Rangkorrelationskoeffizienten für PSU, CMT, XA und TRP betrugen 0,73, 0,95, 0,94 und 0,90. Insgesamt kann festgehalten werden, dass die Korrelation der zielgerichteten und nicht zielgerichteten Plattformen sicherlich abhängig von den angewendeten Instrumenten und Methoden sowie den Metaboliten und deren Konzentration ist. Daher ist eine Verallgemeinerung der Resultate nur sehr eingeschränkt möglich.
Metadaten zuletzt geändert: 25 Nov 2020 16:32
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