| License: Creative Commons Attribution 4.0 (11MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-435075
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.43507
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 1 March 2021 |
| Referee: | Prof. Dr. Gunter Meister and Prof. Dr. Inga Neumann |
| Date of exam: | 7 July 2020 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Zoologie > Tierphysiologie/Neurobiologie (Prof. Dr. Inga Neumann) Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Lehrstuhl für Biochemie I |
| Keywords: | social fear, non-coding RNA, lncRNA, Meg3, extinction, RNA-seq, ATAC-seq, CUT&RUN |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences 500 Science > 590 Zoological sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 43507 |
Abstract (English)
Social anxiety disorder (SAD) is characterized by fear and avoidance of social situations and displays the third most common anxiety disorder in society. However, even today, there is only sparse knowledge about the underlying mechanisms of SAD available. So far, applied therapies, which include cognitive-behavioural therapies combined with pharmacological intervention, show indeed partial ...
Abstract (English)
Social anxiety disorder (SAD) is characterized by fear and avoidance of social situations and displays the third most common anxiety disorder in society. However, even today, there is only sparse knowledge about the underlying mechanisms of SAD available. So far, applied therapies, which include cognitive-behavioural therapies combined with pharmacological intervention, show indeed partial achievements, but still with a high rate of non-responders and relapse. For the development of specific and more efficient treatment options, a better understanding of especially molecular mechanisms is urgently required. Here, RNA molecules are promising to provide insights on a regulatory as well as subsequently translational level during the state of SAD. In general, coding and non-coding RNAs are dynamically regulated as response to certain stimuli and their dysregulation lead to tremendous effects. Disorders are usually linked to pre- and post-transcriptional alterations and approaching these in context of SAD will help to identify disorder-causing signalling pathways and networks.
Thus, the thesis presented here aimed to characterize RNA profiles that are regulated in context of social fear acquisition and its extinction with a total RNA-Sequencing (RNA-Seq) approach. Therefore, I mimicked social fear in male mice by inducing social avoidance – the core symptom of social fear – using the social fear conditioning paradigm (SFC). SFC allows us to induce social fear during social fear acquisition, whereas during social fear extinction training, which is comparable to exposure therapy in humans, animals re-learn to investigate presented conspecifics again. For total RNA-Seq, samples were collected 90 min after the last behavioural assessment during the SFC protocol, with a specific focus on conditioned (SFC+) animals that showed different extinction-success. Here, the septum was chosen as the brain region of interest as it is proven as an important regulator of social fear expression. RNA-Seq revealed many different RNAs regulated on a gene-based and a transcript-based level and after validation of interesting RNA candidates e.g. Sgk1 and Crfr2 among others, with qPCR, I focused mainly on the long non-coding RNA (lncRNA) Meg3, which was regulated in a Meg3 transcript- and extinction success-dependent manner. In more detail, the Meg3 variants containing an alternatively spliced long exon 10 were downregulated in SFC+ animals 24 h after social fear acquisition and levels were restored in case mice could successfully overcome their social fear during the extinction training. In contrast, animals that stayed fearful after the extinction training still displayed reduced Meg3 level even 3 h after extinction training. Control experiments revealed that learning processes, and not social contact per se, are necessary for Meg3 regulation within the septum. Additionally, unique septal Meg3 expression patterns were found compared to hippocampal regions. In vivo Meg3 knockdown within the septum was achieved by the local application of antisense LNA GapmeRs that induce RNaseH-dependent cleavage of specific Meg3 variants. Meg3 knockdown before acquisition and before extinction training revealed that social fear acquisition was not affected, whereas the extinction and the subsequent memory consolidation seemed to be slightly impaired. Furthermore, I investigated the activation of the PI3K/AKT signalling pathway as it was shown to regulate plasticity and long-term potentiation in neurons, and to be modulated by Meg3. Interestingly, I found increased phosphorylation levels of the regulatory subunit P85 of the PI3K and AKT at Ser473 in SFC+ animals 3 h after unsuccessful extinction training, indicating an activation of this signalling pathway. Activation in successfully extinguishing animals is conceivable to happen at earlier time points and therefore deserves further investigation. In Meg3 knockdown experiments, I observed an activation of PI3K in SFC+ control mice. In contrast, SFC+ knockdown mice showed no increased activation compared to unconditioned (SFC-) knockdown mice, which might be due to high basal PI3K activation in SFC- knockdown mice. Taken together, the presented data provide first, but strong indications on a regulatory link between Meg3 and PI3K/AKT signalling after social fear extinction training. Interestingly, many lncRNAs function as transcription regulators of target genes by altering chromatin structures. To assess changes in chromatin accessibility and histones modifications after social fear extinction on a general level, but also with a direct link to Meg3 for the identification of nuclear Meg3 action sites, I performed ATAC-Seq and CUT&RUN for H3K27me3.
In a second part, I further strengthened the role of the septum in social fear extinction processes. Based on originally planned microdialysis experiments for monitoring released neurotransmitter during social fear extinction, I observed that the implantation of the microdialysis probe into the lateral septum itself is sufficient to completely impair social fear extinction in male mice. The unilaterally caused damage still inhibited extinction even if an increased number of social stimuli was presented.
In summary, I was able to generate new data on altered transcriptomics, chromatin accessibility and histone modification H3K27me3 alterations in the context of social fear. Altogether, these data provide a solid background for the further investigation of molecular mechanisms involved in social fear and its extinction. Moreover, I could show for the first time that a lncRNAis dynamically regulated in social fear. Control experiments revealed the importance of learning and memory processes for Meg3 regulation. Moreover, region-specific Meg3 regulation during SFC as well as impaired social fear extinction after septal implantation of a microdialysis probe strengthened the role of the septum in social fear Regulation.
Translation of the abstract (German)
Soziale Angst ist durch Angst und Vermeidungsverhalten von sozialen Situationen charakterisiert und stellt die dritthäufigste Angsterkrankung in unserer Gesellschaft dar. Trotz alledem ist auch heute noch wenig über die zugrundeliegenden Mechanismen bekannt. Aktuell zeigen angewandte Therapieansätze, die meist kognitive Verhaltenstherapien mit Medikationen kombinieren, erste Teilerfolge. Jedoch ...
Translation of the abstract (German)
Soziale Angst ist durch Angst und Vermeidungsverhalten von sozialen Situationen charakterisiert und stellt die dritthäufigste Angsterkrankung in unserer Gesellschaft dar. Trotz alledem ist auch heute noch wenig über die zugrundeliegenden Mechanismen bekannt. Aktuell zeigen angewandte Therapieansätze, die meist kognitive Verhaltenstherapien mit Medikationen kombinieren, erste Teilerfolge. Jedoch gibt es weiterhin viele Patienten, die nicht darauf ansprechen oder schnell rückfällig werden. Um spezifische und effizientere Behandlungsmöglichkeiten entwickeln zu können, ist vor allem ein besseres Verständnis über die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen von Nöten. Hierbei sind RNA-Moleküle besonders vielversprechend, Einblicke in die molekularen Gegebenheiten, sowohl auf regulatorischer als auch auf nachfolgend translationaler Ebene, bei sozialer Angst zu geben. Generell sind kodierende und nicht-kodierende RNAs als Reaktion auf bestimmte Stimuli sehr dynamisch reguliert und ihre Fehlregulation hat meist schwerwiegende Auswirkungen zur Folge. Da Krankheiten oftmals mit spezifischen prä- und posttranskriptionellen Modifikationen verbunden sind, kann deren genauere Untersuchung im Kontext von sozialer Angst Aufschluss auf krankheitsrelevante Signalwege und deren Netzwerke geben.
Aus diesem Grund wurde die vorgelegte Doktorarbeit mit dem Ziel verfasst, RNAs, die durch soziale Angstkonditionierung und deren Löschung reguliert werden, mittels RNA-Sequenzierung zu identifizieren und zu charakterisieren. Hierzu habe ich mit Hilfe sozialer Angstkonditionierung soziales Vermeidungsverhalten, die Kernkomponente von sozialer Angst, in männlichen Mäusen induziert. Die soziale Angstkonditionierung ermöglicht die Etablierung von sozialer Angst, wohingegen bei der Angstlöschung, welche vergleichbar zur Konfrontationstherapie beim Menschen ist, die Mäuse lernen, wieder ungestraften Kontakt zu Artgenossen aufzunehmen. Für die RNA-Sequenzierung wurde 90 min nach der letzten Verhaltenstestung der sozialen Angstkonditionierung oder Angstlöschung RNA aus dem Septum der Mäuse isoliert. Hierbei lag ein spezielles Augenmerk auf konditionierten (SFC+) Mäusen, die die Angstlöschung mit unterschiedlichem Erfolg abgeschlossen haben. Das Septum wurde als Zielregion gewählt, da dessen wichtige Funktion für die Regulation von sozialer Angst bereits mehrfach gezeigt wurde. Durch die RNA-Sequenzierung wurden viele RNAs identifiziert, die sowohl auf Gen- als auch auf Transkript-basierter Ebene reguliert waren. Nach anschließender Validierung mittels qPCR von auserwählten RNA-Kandidaten wie beispielsweise Sgk1, Crfr2 und weiteren, habe ich mich hauptsächlich auf die lange nicht-kodierende RNA Meg3 fokussiert, welche transkriptspezifisch und in Abhängigkeit von einer erfolgreichen Angstlöschung reguliert war. Genauer betrachtet waren jene Meg3-Varianten, die ein langes alternativ gespleißtes Exon 10 enthielten, 24 h nach der Angstkonditionierung in SFC+ Mäusen herunterreguliert. Mäuse, die ihre soziale Angst während des Trainings zur sozialen Angstlöschung überwunden hatten, konnten die Expressionslevel zu unkonditionierten (SFC-) Tieren wieder angleichen. Tiere, die nach dem Training zur Angstlöschung noch immer sozial verängstigt waren, wiesen jedoch sogar noch 3 h nach dem Training niedrige Meg3-Levels auf. Kontrollversuche zeigten, dass Lernprozesse, und nicht soziale Interaktion alleine, für die Regulation von Meg3 nötig sind. Außerdem wurde Meg3 speziell im Septum, und nicht im Hippocampus reguliert vorgefunden. Um in vivo einen Meg3 Knockdown im Septum zu erzielen, wurden antisense LNA GapmeRs, die einen RNase H-abhängigen Abbau von spezifischen Meg3-Varianten induzieren, lokal verabreicht. Meg3 Knockdown-Versuche vor der Angstkonditionierung und vor dem Training zur Angstlöschung zeigten keine Auswirkungen auf die Angstkonditionierung, wohingegen die Angstlöschung und die anschließende Gedächtnisbildung und -festigung etwas beeinträchtigt zu sein schienen. Des Weiteren habe ich die Aktivierung des PI3K/AKT Signalweges untersucht, da diese bewiesenermaßen neuronale Plastizität und Langzeitpotenzierung reguliert und selbst von Meg3 moduliert wird. Interessanterweise konnte ich zeigen, dass die Phosphorylierungslevels von P85, der regulatorischen Untereinheit von PI3K, und AKT Ser473 3 h nach dem Training zur Angstlöschung in Tieren, die die Angst nicht erfolgreich löschen konnten, erhöht waren. Dies lässt auf eine Aktivierung des Signalweges schließen. Es ist denkbar, dass die Aktivierung in Tieren, die ein erfolgreiches Training zur Angstlöschung durchliefen, zu einem früheren Zeitpunkt stattfindet, was weitere Untersuchungen bedarf. In Meg3 Knockdown-Experimenten habe ich eine Aktivierung von PI3K in SFC+ Kontrolltieren beobachtet. Dieser Effekt blieb jedoch in SFC+ Knockdown-Tieren aus, was an den basal erhöhten Aktivierungslevels, die in SFC- Knockdown-Tieren aufzufinden waren, begründet sein könnte. Insgesamt stellen die hier präsentierten Ergebnisse erste, aber bedeutende Hinweise über einen regulatorischen Zusammenhang von Meg3 und dem PI3K/AKT Signalweg nach dem Training zur sozialen Angstlöschung dar, welche noch weiter untersucht werden sollten. Interessanterweise regulieren viele lange nicht-kodierende RNAs die Transkription, indem sie Chromatinstrukturen beeinflussen. Deshalb habe ich ATAC-Seq und CUT&RUN durchgeführt, um Veränderungen auf Chromatinebene und der Histonmodifikation H3K27me3 zu charakterisieren. Hierbei wurden Veränderungen nach der sozialen Angstlöschung im allgemeinem, aber auch mit einem direkten Link zu Meg3 untersucht, um nukleare Interaktionsstellen von Meg3 für Zukunftsexperimente zu identifizieren.
In einem zweiten Teil der Dissertation, habe ich die Rolle des lateralen Septums für Prozesse der sozialen Angstlöschung weiter bestärkt. Basierend auf anfänglich geplanten Mikrodialyse-Experimenten, die die Freisetzung von Neurotransmittern detektieren sollten, musste ich feststellen, dass die alleinige Implantation der Mikrodialyse-Sonde in das LS ausreichend war, die soziale Angstlöschung in männlichen Mäusen stark zu beeinträchtigen. Der unilateral verursachte Gewebsschaden verhinderte die Angstlöschung weiterhin, auch bei einer Erhöhung der Anzahl an präsentierten sozialen Stimuli.
Zusammenfassend konnte ich neue Daten über Veränderungen des Transkriptoms, der Chromatinzugänglichkeit und der Histonmodifikation H3K27me3 im Kontext von sozialer Angst generieren. All dies stellt ein solides Grundgerüst für die weitere Untersuchung von molekularen Mechanismen, die bei sozialer Angst und deren Löschung involviert sind, dar. Außerdem konnte ich erstmals zeigen, dass eine lange nicht-kodierende RNA dynamisch in sozialer Angst reguliert ist. Kontrollexperimente zeigten, dass Lern- und Gedächtnisprozesse für die Regulation von Meg3 notwendig sind. Zusätzlich bestärkten die regionsspezifische Meg3-Regulation und die eingeschränkte Angstlöschung bei septaler Implantation einer Mikrodialyse-Sonde die Rolle des LS in der Regulation von sozialer Angst.
Metadata last modified: 01 Mar 2021 07:30
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