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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-435802
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.43580
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 14 June 2021 |
| Referee: | Prof. Dr. Günther Bernhardt |
| Date of exam: | 24 July 2020 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical/Medicinal Chemistry II (Prof. Buschauer) |
| Keywords: | NPY (Y1R, Y2R, Y4R, Y5R), argininamide, antagonists, non-Peptide, SAR, fluorescent Ligand |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences 600 Technology > 615 Pharmacy |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 43580 |
Abstract (English)
Neuropeptide Y (NPY), peptide YY (PYY) and pancreatic polypeptide (PP) share similarities, such as a sequence comprising 36 amino acids and an amidated C-terminus, which activate NPY receptors. These receptors belong to class A (rhodopsin-like receptors) of G-protein coupled receptors (GPCRs),[1] which are distributed in the central nervous system (CNS) and as well in the periphery.[2] In humans ...
Abstract (English)
Neuropeptide Y (NPY), peptide YY (PYY) and pancreatic polypeptide (PP) share similarities, such as a sequence comprising 36 amino acids and an amidated C-terminus, which activate NPY receptors. These receptors belong to class A (rhodopsin-like receptors) of G-protein coupled receptors (GPCRs),[1] which are distributed in the central nervous system (CNS) and as well in the periphery.[2] In humans four (Y1R, Y2R, Y4R and Y5R) different subtypes are functional and their stimulation leads to several biological effects, which are involved in several dysfunctions such as dislocation of energy homeostasis, seizure, neurodegeneration and psychotic disorders.[2-4] Furthermore, the overexpression of NPY receptors in different tumuors (e.g. overexpression of Y1R in breast cancer) make them a promising target for cancer imaging and therapy.[5]
The (R)-argininamide-type Y1R antagonist UR-MK299 (2.2) was recently co-crystallized with the hY1R and revealed that the Nω-carbamoyl substituent (van der Waals volume: 139 Å3) is deeply buried in the receptor, occupying a hydrophobic pocket that is not completely filled.[6, 7] (R)-Argininamides 2.53-2.76 and 2.78, derived from 2.2 and 2.3 were synthesized and pharmacologically characterized (e.g. radioligand competition binding assay, Fura-2 Ca2+ assay). The propionyl group in 2.2 was replaced by several acyl residues (cyclic, acyclic and aromatic). In addition the ethylene spacer in 2.2 was replaced by a propylene spacer bearing acetyl or propionyl moieties. A decrease in Y1R affinity was observed with increasing size of the carbamoyl residue (minimal pKi = 5.67). When the van der Waals volume (212 Å3) of the side chain reached a critical size, the binding mode of argininamide-type ligands inverted and the carbamoyl side chain was located at the surface of the receptor. These findings were supported by induced-fit docking and molecular dynamics simulations (cf. Chapter 2).
Additionally, selected (R)-argininamides 2.1, 2.2, 2.56-2.59, 2.61 and 2.65 were investigated in a β arrestin2 recruitment assay. Compounds 2.58, 2.68 and 2.72 were supposed to share a similar binding mode to 2.2, however the increasing size of the carbamoyl residue of these ligands did not result in hY4R and hY5R binding. Additionally, potential irreversibly binding compounds 2.60 and 2.63 identified by model chemical reactivity experiments with 2-mercaptoethanol were investigated in saturation binding experiments with [3H]2.2 as radioligand. However, covalent binding of 2.60 and 2.63 to the hY1R could neither be confirmed nor excluded (cf. Chapter 3).
The (S)-argininamide BIIE-0246 (4.1) was the first selective hY2R antagonist known from the literature8 and acylation of the guanidine group of 4.1 led to [3H]UR-PLN196 ([3H]4.2),[9] which was the first non-peptide hY2R radioligand synthesized in our group. In a further project, the replacement of the benzoazepinone moiety of 4.1 by an amino functionalized benzhydryl group led to compounds 4.50 and 4.51 with binding affinities in the nanomolar range. Derived from 4.50, the red-emitting fluorescent ligand UR-jb264 (4.58) was synthesized. 4.58 was successfully used in a BRET based binding assay as an alternative to radioligand binding with [3H]propionyl-pNPY as a tracer for the determination of binding constants of Y2R ligands. Additionally, 4.58 was applied in confocal microscopy (cf. Chapter 4).
Compound 4.23 derived from (S)-argininamide 4.5 is the cold form of a potential radioligand. To explore the feasibility of future tritium labelling of 4.23 by methylation (e.g. with methyl iodide or methyl nosylate) in the last synthetic step, the phenolic precursor 5.20 was synthesized. Furthermore, the amine precursor 4.50 was propionylated (5.31), 2-fluoroacetylated (5.32), mono- (5.29) and tri- (5.30) alkylated to obtain additional cold forms of potential radioligands (cf. Chapter 5).
Ewing et al.[10, 11] reported a series of (R,R)-diaminocyclohexanes, which were classified as agonists antagonists or modulators. These authors evaluated just a subset of compounds at the hY4R in a cAMP accumulation assay. In a third project, selected compounds were synthesized and investigated in competition binding experiments at the hY4R, established in our group. Unfortunately, the compounds showed no affinity in competition binding experiments. Additionally, selected compounds were investigated in an aequorin assay and showed neither potency nor modulatory effects on the action of hPP. Niclosamide (6.10) was described as the first allosteric modulator at the hY4R,[12] but the reported results could not be reproduced in the aequorin assay using live CHO-hY4-Gqi5-mtAEQ cells. Live/dead staining of the cells revealed that niclosamide (6.10) proved to be cytotoxic at the used concentrations, compromising the results of functional assays with live cells (cf. Chapter 6).
First and foremost, this thesis contributes to a deeper insight on the binding mode of Nω-carbamoylated (R) argininamide at Y1R, which may help to design and prepare further novel molecular tools such as fluorescence labelled or PET ligands. Furthermore, the synthesis of amine precursor 4.50 enables the synthesis of fluorescent ligand 4.58, which could be used for the determination of binding constants of non-labelled compounds.
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[11] Ewing, W. R.; Zhu, Y.; Sun, C.; Huang, Y.; Sivasamban, M.; Karatholuvhu; Bolton, S. A.; Pasunoori, L.; Mandal, S. K.; Sher, P. M. Diaminocyclohexane compounds and uses thereof. US 2013/0184284 A1, 2013.
[12] Sliwoski, G.; Schubert, M.; Stichel, J.; Weaver, D.; Beck-Sickinger, A. G.; Meiler, J. Discovery of Small-Molecule Modulators of the Human Y4 Receptor. PLOS ONE 2016, 11, e0157146.
Translation of the abstract (German)
Neuropeptid Y (NPY), Peptid YY (PYY) und das pankreatische Polypeptid (PP) weisen strukturelle Ähnlichkeiten auf. So teilen sie z.B. eine Sequenz mit 36 Aminosäuren und besitzen einen amidierten C-Terminus. Diese Rezeptoren gehören zur Klasse A der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs), welche sowohl im Zentralnervensystem (ZNS) sowie in der Peripherie vorkommen. Beim Menschen sind vier (Y1R, ...
Translation of the abstract (German)
Neuropeptid Y (NPY), Peptid YY (PYY) und das pankreatische Polypeptid (PP) weisen strukturelle Ähnlichkeiten auf. So teilen sie z.B. eine Sequenz mit 36 Aminosäuren und besitzen einen amidierten C-Terminus. Diese Rezeptoren gehören zur Klasse A der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs), welche sowohl im Zentralnervensystem (ZNS) sowie in der Peripherie vorkommen. Beim Menschen sind vier (Y1R, Y2R, Y4R und Y5R) verschiedene Subtypen funktionsfähig und ihre Stimulation führt zu verschiedenen biologischen Effekten, die an verschiedenen Funktionsstörungen beteiligt sind. Darüber hinaus sind NPY-Rezeptoren in verschiedenen Tumoren überexprimiert (z. B. Überexpression von Y1R bei Brustkrebs), welches sie zu einem vielversprechenden strukturellen Target für die Bildgebung und Therapie von Krebs machen.
Der Y1R Antagonist UR-MK299 (2.2) vom (R)-Argininamidtyp wurde kürzlich mit dem hY1R kristallisiert und es war offensichtlich, dass der Nω-carbamoyl-Substituent (van der Waals Volumen: 139 Å3) tief im Rezeptor in einer hydrophoben Tasche taucht, die nicht vollständig besetzt zu sein scheint.6, 7 Es wurden die (R)-Argininamide 2.53-2.76 and 2.78, ausgehend von 2.2 and 2.3 synthetisiert und pharmakologisch charakterisiert (z.B. in Radioliganden-Bindungsexperimenten, Fura-2 Ca2+ Assay). Der Propionylrest in 2.2 wurde durch verschiedene Acylreste ersetzt (zyklische, azyklische and aromatische Reste). Zusätzlich wurde der Ethylenlinker in 2.2 durch einen Propylenlinker ausgetauscht, welche mit einer Acetyl- oder Propionylgruppe substituiert sind. Mit zunehmender Größe des Carbamoylsubstituenten konnte eine Abnahme an Y1R Affinität beobachtet werden (kleinster pKi = 5.67). Wenn das van Waals Volumen (212 Å3) der Seitenkette eine kritische Größe erreicht hat, invertiert der Bindungsmodus der Liganden vom Argininamidtyp und die Seitenkette orientiert sich zur Rezeptoroberfläche. Die Erkenntnisse konnten durch „induced-fit docking“ und „molecular dynamics“ Simulationen unterstützt werden (vgl. Kapitel 2).
Ausgewählte (R)-Argininamide 2.1, 2.2, 2.56-2.59, 2.61 und 2.65 wurden in einem β Arrestin2 recruitment Assay untersucht. Die Verbindungen 2.58, 2.68 and 2.72 zeigen basierend auf diesen Daten einen ähnlichen Bindungsmodus wie 2.2. Ein größer werdendes Volumen des Carbamoyl Substituenten resultiert nicht in einer erhöhten Affinität der Liganden zu anderen Rezeptorsubtypen (hY4R and hY5R). Zusätzlich wurden die Liganden 2.60 and 2.63 als potenziell kovalent bindende Verbindungen in einem Modellexperiment mit 2-Mercapntoethanol und in einem Sättigungsexperiment mit [3H]2.2 als Radioligand untersucht. Es konnte eine kovalente Binding der Liganden 2.60 and 2.63 mit dem hY1R weder ausgeschlossen noch bestätigt werden (vgl. Kapitel 3).
Der Austausch der Benzoazepinon-Partialstruktur in BIIE-0246 (4.1) durch eine aminofunktionalisierte Benzhydryl-Partialstruktur führte zu den Liganden 4.50 and 4.51, welche Y2R Affinität im nanomolaren Bereich aufweisen. Ausgehend von 4.50, wurde der Fluoreszenzligand UR-jb264 (4.58) synthetisiert, welcher erfolgreich in einem BRET basierten Bindungsexperiment zur Bestimmung von Bindungskonstanten von Y2R Liganden angewendet wurde. Das BRET basierte Bindungsexperiment stellt eine Alternative zu Radioliganden-Bindungsexperimenten mit [3H]propionyl-pNPY dar. Ebenso wurde 4.58 in der Konfokal-Mikroskopie angewendet (vgl. Kapitel 4).
Verbindung 4.23, welche ausgehend vom (S)-Argininamid 4.5 synthetisiert wurde, stellt die kalte Form eines Radioliganden dar. Eine zukünftige Tritium-Markierung von 4.23 durch Methylierung mit Methyliodid oder Methylnosylat im letzten Syntheseschritt, machen es notwendig das Phenol 5.20 als Vorstufe zu synthetisieren. Ebenso wurde die Amino-Vorstufe 4.50 propionyliert (5.31), 2-fluoroacetyliert (5.32), mono- (5.29) und tri- (5.30) alkyliert, um zusätzliche kalte Formen von potenziellen Radioliganden zu erhalten (vgl. Kapitel 5).
Weiterhin wurde eine Serie von (R,R)-Diaminocyclohexanen synthetisiert und in Radioliganden-Bindungsexperimenten am Y4R untersucht. Diese Verbindungen zeigten allerdings keine Affinität in den Radioliganden-Bindungsexperimenten. Zusätzlich wurden ausgewählte Verbindungen in einem Aequorin-Assay getestet und zeigten weder eine agonistische Aktivität noch einen modulatorischen Effekt auf die Wirkung von hPP.
Niclosamide (6.10) ist als erster positiv allosterischer Modulator am hY4R beschrieben, aber die in der Literatur berichteten Effekte konnten nicht im Aequorin-Assay unter Verwendung von lebenden CHO-hY4-Gqi5-mtAEQ Zellen reproduziert werden. Eine Lebend-/Tod Färbung der verwendeten Zellen zeigte zytotoxische Effekte von Niclosamide (6.10) im verwendeten Konzentrationsbereich (Vgl. Kapitel 6).
Die Resultate dieser Arbeit geben einen tieferen Einblick in den Bindungsmodus von Nω-carbamoyliertem (R)-Argininamiden am Y1R, welcher für die Synthese und das Design neuer molekulare Werkzeuge wie fluoreszenzmarkierte oder PET-Liganden notwendig ist. Darüber hinaus kann der synthetisierte Fluoreszenzligand (4.58) zur Bestimmung der Bindungskonstanten nicht markierter Verbindungen verwendet werden.
Metadata last modified: 14 Jun 2021 05:54
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