Die Entwicklung neuartiger therapeutische Antikörper ist einer der sich am stärksten und schnellsten entwickelnden Teilbereiche der modernen Arzneimittelforschung. Antikörper sind hochspezifisch für ihr Antigen und können aufgrund ihrer hohen Sequenzvariabilität gegen eine Vielzahl von Ziel-Strukturen (Oberflächenmarker, Zytokine etc.) generiert werden.
Ein interessantes Zytokin ist das ...
Abstract (German)
Die Entwicklung neuartiger therapeutische Antikörper ist einer der sich am stärksten und schnellsten entwickelnden Teilbereiche der modernen Arzneimittelforschung. Antikörper sind hochspezifisch für ihr Antigen und können aufgrund ihrer hohen Sequenzvariabilität gegen eine Vielzahl von Ziel-Strukturen (Oberflächenmarker, Zytokine etc.) generiert werden.
Ein interessantes Zytokin ist das hämatopoetische Zytokin IL-3. Dieses wird von verschiedenen Immunzellen gebildet (z.B. T-Zellen, Basophilen Granulozyten, B-Zellen), aktiviert eine Vielzahl von Immunzellen und trägt zur Entstehung von Autoimmunität und Inflammation bei. In unterschiedlichen Tiermodellen und Untersuchungen bei Patienten wurde ein stimulierender Einfluss von IL-3 auf die Entstehung von Autoimmunität und Entzündung gefunden (z.B. Sepsis, Multiple Sklerose und Lupusnephritis). Dies macht IL-3 zu einem vielversprechenden Ziel für therapeutische Antikörper.
Fragestellungen, die in dieser Arbeit beantwortet werden sollten, sind die Expression, Wirkung und Hemmung von IL-3 mit humanen Leukozyten. Die Effekte von IL-3 wurden mittels FACS analysiert und darauf basierend Assays zur Beurteilung der IL-3-Inhibition entwickelt.
Von einem murinen anti-human IL-3-Antikörper ausgehend lag der Schwerpunkt der Arbeit auf der Generierung und Charakterisierung eines humanisierten IL-3-Antikörpers. Zudem musste der Antikörper hinsichtlich wichtiger Parameter wie Stabilität, Affinität und Zytotoxizität untersucht werden, um beurteilen zu können, ob der Antikörper als Therapeutikum geeignet sein könnte. Hierfür wurden Protokolle für etablierte Methoden wie ELISA, FACS, SEC, SPR und DSC erarbeitet.
Als Hauptproduzenten von IL-3 konnten die Ttm und Tte CD28hi Subpopulationen der CD4+ und CD8+ T-Zellen identifiziert werden (CD3+ (CD4+/CD8+) CCR7- (CD45RA+/) CD28+). Insbesondere Basophile Granulozyten zeigten sich als höchst sensitiv und nahezu exklusiv reagierend auf IL-3, bei Betrachtung des CD131-Rezeptors. Daher konnte mit Hilfe der Basophilen Granulozyten ein geeigneter und schneller Assay zur Auswahl der besten humanisierten Antikörpervariante entwickelt werden. Diese Variante bewirkte eine komplette Inhibierung der Aktivität von IL-3, ohne ungewünschte Nebeneffekte zu erzeugen. Auch weitere Parameter wie Stabilität, Affinität und Spezifität lieferten überzeugende Ergebnisse, sodass diese Antikörpervariante als möglicher Kandidat zur Therapie bestimmter Autoimmunerkrankungen, wie Lupusnephritis, in Betracht gezogen werden kann.
Translation of the abstract (English)
The development of new therapeutic antibodies is one of the fastest evolving areas of modern drug research. Especially antibodies are of great interest because of their ability to bind a large variety of molecular targets.
IL-3 is secreted by different immune cells (e.g. T cells, basophils, B cells). In addition, it plays a crucial role in activating and stimulating a variety of immune cells and ...
Translation of the abstract (English)
The development of new therapeutic antibodies is one of the fastest evolving areas of modern drug research. Especially antibodies are of great interest because of their ability to bind a large variety of molecular targets.
IL-3 is secreted by different immune cells (e.g. T cells, basophils, B cells). In addition, it plays a crucial role in activating and stimulating a variety of immune cells and inducing autoimmunity and inflammation. Various animal models and experiments in patients showed the contribution of IL-3 for development of autoimmunity and inflammation (e.g. sepsis, multiple sclerosis, lupus nephritis).
In this thesis the expression of IL-3, downstream effects of IL-3 and inhibition of IL-3 was studied with human leukocytes. The effects of IL-3 were analyzed by FACS and assays for assessment of IL-3 inhibition were developed.
The main goal was to humanize a murine anti-human IL-3 antibody and to characterize the humanized variants. Additionally, the best-humanized variant was analyzed regarding stability; affinity and cytotoxicity in order to assess its suitability as a future therapeutic. For this, adapted protocols for ELISA, FACS, SEC, SPR and DSC were developed.
The Ttm and Tte CD28hi subpopulations of CD4+ and CD8+ T cells (CD3+ (CD4+/CD8+) CCR7- (CD45RA+/) CD28+) could be identified as main source of IL-3. Especially basophils reacted highly sensitive to IL-3 in assays measuring downregulation of the CD131 receptor. Based on these results a fast and reliable test was established to choose the best-humanized antibody variant. This variant was able to completely inhibit IL-3 activity without unwanted side effects. Further characterization provided additional data regarding stability, affinity and specificity. Altogether, this humanized antibody appeared as promising candidate for further development as a therapeutic antibody.
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