Der Lichteinfall im Auge, der uns die visuelle Wahrnehmung unserer Umgebung ermöglicht, führt in der Retina zu einer Belastung der Zellen mit oxidativem Stress. Als Reaktion darauf kommt es zur Aktivierung des Komplementsystems, welches eine bedeutende Rolle in der Pathogenese verschiedener Augenerkrankungen spielt.
In der vorliegenden Dissertation werden Forschungen zur Funktion des Komplement- ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Der Lichteinfall im Auge, der uns die visuelle Wahrnehmung unserer Umgebung ermöglicht, führt in der Retina zu einer Belastung der Zellen mit oxidativem Stress. Als Reaktion darauf kommt es zur Aktivierung des Komplementsystems, welches eine bedeutende Rolle in der Pathogenese verschiedener Augenerkrankungen spielt.
In der vorliegenden Dissertation werden Forschungen zur Funktion des Komplement- stabilisierenden Modulators Properdin an ARPE-19 Zellen, einer humanen retinalen Pigmentepithel (RPE) -Zelllinie, unter oxidativem Stress angestellt. Zunächst wurde eine RPE-Kultivierungsmethode herausgearbeitet, durch die die zellmorphologischen Merkmale von ARPE-19 Zellen in vitro deutlicher realisiert werden konnten, als durch die bisher in der Arbeitsgruppe etablierte Kultivierungsmethode. Durch eine ZO1- Färbung konnte für die pigmentierten Zellen eine markantere Ausbildung der RPE- typischen „Pflasterstein-Form“ und der Zell-Zell-Kontakte, die zur Ausbildung einer epithelialen Einzelzellschicht führen, sichtbar gemacht werden. Auch in Hinsicht auf die Werte für den transepithelialen Widerstand und die Membranfläche waren die Zellen der neuen Kultivierungsmethode überlegen. Nichtsdestotrotz konnte im Vergleich der Zellen beider Kultivierungsmethoden unter oxidativen Stressbedingungen eine korrelierende Expressionsänderung der Komplementfaktoren ctsl, il-1β, c5aR und nlrp3 mittels qPCR festgestellt werden. ARPE-19 Zellen, anhand der neuen Methode kultiviert und weiterhin oxidativem Stress ausgesetzt, wurden daraufhin mit exogenem Properdin behandelt. Dabei wurde durch Immunfärbungen und Western Blot ersichtlich, dass exogenes Properdin an die gestressten Zellen bindet. Auf mRNA-Ebene induzierte das exogene Properdin nach 4 h eine Steigerung der Expression für die Komplementfaktoren il-18, ctsl und cfp, sowie eine Verringerung für nlrp3. Durch einen Sandwich-ELISA wurde im apikalen Überstand vermehrt Properdin, das von der Zelle selbst gebildet wurde, detektiert. So konnte geschlussfolgert werden, dass Properdin sich selbst in einer Rückkopplungsschleife reguliert, indem es an die Zellen bindet, deren Expression beeinflusst und die apikale Sekretion von Properdin steigert, welches wiederum an die Zelle bindet. Zusätzlich konnte in Hinsicht auf die apikale Sekretion der ARPE-19 Zellen ein steigernder Effekt des exogenen Properdins auf die Ausschüttung der Komplementfaktoren C1q, MBL, CFD und CFI mittels Multiplex-ELISA beobachtet werden.
Im nächsten Schritt wurden die ARPE-19 Zellen mit Serum behandelt, welches alle Bestandteile, außer Properdin, enthielt. Dies führte zu einer zeitabhängigen Erhöhung der Expression von cfp, cfd und c4 nach 4 h im Vergleich zu lediglich gestressten Zellen. Die Komplettierung des Serums durch Properdin hatte auf dieses Ergebnis keine signifikanten Auswirkungen. Jedoch wurde die durch exogenes Properdin deutlich gesteigerte Sekretion von Properdin durch die Beteiligung der anderen Faktoren aus dem Serum abgeschwächt. Der Selbstregulationszyklus von Properdin wird also in Anwesenheit der Gänze von Komplementfaktoren durch andere Effekte überlagert.
In der Gesamtheit konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass der singuläre Komplementregulator Properdin die Zellphysiologie von gestressten RPE-Zellen regulieren kann, diese Wirkung aber im Zusammenspiel aller Serumproteine gegenreguliert wird um ein homöostatisches Gleichgewicht zu gewährleisten.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
For the perception of the environment our eyes are exposed to light, resulting in oxidative stress for the retinal cells. They react with an activation of the complement system, which is relevant for the pathogenesis of various eye diseases.
In this thesis the role of the complement stabilizing regulator properdin was investigated on ARPE-19 cells, a human RPE-cell line, under oxidative stress ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
For the perception of the environment our eyes are exposed to light, resulting in oxidative stress for the retinal cells. They react with an activation of the complement system, which is relevant for the pathogenesis of various eye diseases.
In this thesis the role of the complement stabilizing regulator properdin was investigated on ARPE-19 cells, a human RPE-cell line, under oxidative stress conditions. First, a cultivation method was developed, which revealed the cell morphological characteristics of ARPE-19 cells in vitro better than the former cultivation method in the working group. The typical „cobblestone appearance“ and tight junctions, resulting in an epithelial monolayer, could be achieved in pigmented cells, as shown by ZO1-staining. The cells of the new cultivation method showed increased transepithelial resistance and the membrane capacity as well. Nevertheless, the cells of both cultivation methods showed correlative changes in expression for the complement factors ctsl, il-1 β, c5aR and nlrp3, when exposed to oxidative stress. This was detected via qPCR.
ARPE-19 cells, cultivated by the new method and still exposed to oxidative stress, were thereupon treated with exogenous properdin. It appeared in immunostainings and western blot, that exogenous properdin binds to the stressed cells. After 4 h the exogenous properdin induced an increase of expression on mRNA-level for il-18, ctsl and cfp, as well as a decrease for nlrp3. Via sandwich-ELISA more properdin, produced by the cell, could be detected in the apical supernatant. The conclusion was drawn that properdin regulates itself in a feedback loop, by binding to the cells, influencing their expression and increasing their apical secretion of properdin, which will bind to the cells again. Additionally the exogenous properdin also had an increasing effect on the apical secretion of C1q, MBL, CFD and CFI of the ARPE-19 cells, as shown by Multiplex-ELISA.
In the next step ARPE-19 cells were treated with properdin-depleted serum. This resulted in a time-dependent increase in mRNA expression after 4 h of cfp, cfd and c4 in comparison to stressed cells. Completing the serum with properdin had no significant effect on that. However, the increased secretion of properdin, triggered by treatment with exogenous properdin, was reduced by the other factors in the serum. Thus, the feedback loop of properdin is overlapped by other effects if all complement components interact.
In summary this thesis shows that the singular complement regulator properdin can regulate the cell physiology of stressed RPE-cells, but also that all serum proteins together go against this effect to ensure a homeostatic balance.
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