| License: Publishing license for publications excluding print on demand (18MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-443377
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.44337
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Date: | 21 December 2020 |
| Referee: | Prof. Dr. Dina Grohmann |
| Date of exam: | 16 December 2020 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Lehrstuhl für Mikrobiologie (Archaeenzentrum) Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Lehrstuhl für Mikrobiologie (Archaeenzentrum) > Prof. Dr. Dina Grohmann |
| Keywords: | Transkription, Kraftspektroskopie, Fluoreszenz |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 44337 |
Abstract (English)
Transcription is the transfer of information stored in the DNA genome into RNA and an essential process for cellular life. In all three domains of life, transcription is carried out by structurally conserved RNA polymerases (RNAP). archaea employ only a single RNAP while eukaryotes have evolved three functionally distinct variants, RNAP I, II and III. Transcription is a cyclic process divided ...
Abstract (English)
Transcription is the transfer of information stored in the DNA genome into RNA and an essential process for cellular life. In all three domains of life, transcription is carried out by structurally conserved RNA polymerases (RNAP). archaea employ only a single RNAP while eukaryotes have evolved three functionally distinct variants, RNAP I, II and III. Transcription is a cyclic process divided into initiation, elongation and termination phases. During transcription initiation, RNAPs are recruited to the promoter region of their target genes by transcription factors (TF) that recognize sequence elements in the promoter DNA, leading to formation of a pre-initiation complex (PIC). In archaeal and all eukaryotic transcription systems, initiation relies on the TATA-binding protein (TBP) and a TFIIB-like factor.
TFIIIB, the central initiation factor of the human RNAP III system is composed of TBP, the TFIIB-related factors Brf1 or Brf2 and the RNAP III-specific factor Bdp1. At TATA-box-containing promoters, TFIIIB alone can recruit RNAP III. In contrast, RNAP II recruitment can be achieved by TBP and TFIIB. How TFIIIB dynamically assembles at the promoter and the role of Bdp1 as an additional required factor are still not well understood. Furthermore, TFIIIB forms highly stable complexes on DNA that can persist for multiple rounds of transcription. How transcription factors are affected by mechanical forces exerted on DNA by cellular processes like transcription and DNA compaction is mostly unexplored. The archaeal transcription machinery resembles the eukaryotic RNAP II system, but gene regulation is performed by Bacteria-like transcriptional regulators. In Pyrococcus furiosus, the TFB recruitment factor 1 (TFB-RF1) can recruit TFB to promoters with a weak B recognition element (BRE) by binding to a conserved upstream promoter element. The molecular mechanism and potential conformational changes in the DNA are still elusive. Many archaea evolved paralogs of TBP and TFB that are involved in stress response. In Sulfolobus acidocaldarius, TFB2, a paralog of TFB is expressed in a cell cycle dependent manner. However, its function in the context of transcription is still unexplored.
Assembly of TFs at the promoters is highly dynamic and involves TBP-induced bending of the promoter DNA by approximately 90°. This conformational change can be detected by Förster resonance energy transfer (FRET), a distance-dependent non-radiative process that can report on distance changes in the 1–10 nm regime with high time resolution. In this work, FRET measurements are performed at the single-molecule level, which allows direct observation of different conformational states of individual initiation complexes in real-time. Furthermore, force measurements were performed with a DNA origami-based nanodevice that can exert constant force in the piconewton range on a double stranded DNA fragment. To facilitate FRET experiments, a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscope was constructed. In this work, TIRF and confocal fluorescence microscopy were used to study the molecular mechanisms underlying human and archaeal transcription initiation.
The stepwise assembly of TFIIIB at the U6 snRNA promoter was monitored, revealing transient DNA binding of TBP on the millisecond timescale. Addition of Brf2 and Bdp1 stabilized dynamic DNA/TBP complexes. Force measurements revealed that binding of human TFs to DNA under mechanical strain is impaired. The complete TFIIIB complex can bind to DNA at forces up to 6.3 pN, whereas binding of TBP and TBP/Brf2 was strongly reduced at 2.6 pN and 6.3 pN, respectively. A comparison with the RNAP II-specific TFIIB and TFIIA provides evidence that the cage-like structure of TFIIIB confers superior resistance to mechanical force.
S. acidocaldarius TFB2 cannot stabilize a bent promoter DNA/TBP complex and is thus not functional as a transcription initiation factor. Instead, six-fold molar excess of TFB2 could destabilize a DNA-bound TBP/TFB complex, suggesting a regulatory role for TFB2.
TFB-RF1 can enhance TFB recruitment at promoters with weak or consensus BREs to similar degree without inducing conformational changes in the DNA. However, formation of a bent promoter DNA complex is slower at promoters with a consensus BRE. TFB-RF1 likely acts as a secondary binding site for TFB.
DNA origami-based force spectroscopy further demonstrated force-dependent DNA bending of archaeal TFs. Methanocaldococcus jannaschii TBP can bend DNA alone whereas P. furiosus requires TBP and TFB. For both systems, low DNA bending efficiency was observed at 6.2 pN force.
Taken together, this work highlights conserved mechanisms employed by archaeal and eukaryotic transcription systems to modulate the stability of the TBP/TFIIB-like factor complex that nucleates PIC formation, thereby enabling control over transcription initiation.
Translation of the abstract (German)
Transkription ist der Transfer von im DNA-Genom gespeicherten Informationen in RNA und daher ein wichtiger Prozess für zelluläres Leben. Transkription erfolgt in allen drei Domänen des Lebens durch strukturell konservierte RNA-Polymerasen (RNAPs). Archaeen verwenden nur eine einzige RNAP, während Eukaryoten drei funktionell unterschiedliche Varianten entwickelt haben, RNAP I, II und III. ...
Translation of the abstract (German)
Transkription ist der Transfer von im DNA-Genom gespeicherten Informationen in RNA und daher ein wichtiger Prozess für zelluläres Leben. Transkription erfolgt in allen drei Domänen des Lebens durch strukturell konservierte RNA-Polymerasen (RNAPs). Archaeen verwenden nur eine einzige RNAP, während Eukaryoten drei funktionell unterschiedliche Varianten entwickelt haben, RNAP I, II und III. Transkription ist ein zyklischer Prozess, der in Initiations-, Elongations- und Terminationsphasen unterteilt ist. Während der Transkriptionsinitiation wird die RNAP durch Transkriptionsfaktoren (TFs), die Sequenzelemente in der Promotor-DNA erkennen, in die Promotorregion ihrer Zielgene rekrutiert. Dies führt zur Formierung eine Prä-Initiationskomplexes (engl.: pre-initiation complex, PIC). Im archaeellen und allen eukaryotischen Transkriptionssystemen bilden das TATA-bindende Protein (TBP) und ein TFIIB-ähnlicher Faktor die Kernkomponenten der Initiation.
TFIIIB, der zentrale Initiationsfaktor des humanen RNAP III-Systems, besteht aus TBP, dem TFIIB-ähnlichen Faktor Brf1 oder Brf2 und dem RNAP III-spezifischen Faktor Bdp1. Die Rekrutierung von RNAP III kann an Promotoren mit einem TATA-box Element allein durch TFIIIB erfolgen. Im Gegensatz dazu kann die Rekrutierung von RNAP II durch TBP und TFIIB erreicht werden. Der dynamische Assemblierungsprozess von TFIIIB auf der Promotor DNA, sowie die Rolle von Bdp1 als zusätzlich erforderlichem Faktor im RNAP III System, sind noch nicht gut untersucht. Darüber hinaus bildet TFIIIB extrem stabile Komplexe mit DNA, die für mehrere Transkriptionszyklen bestehen bleiben können. Wie Transkriptionsfaktoren durch mechanische Kräfte beeinflusst werden, die durch zelluläre Prozesse wie Transkription und DNA-Kompaktierung auf die DNA ausgeübt werden, ist weitgehend unerforscht. Die archaeelle Transkriptionsmaschinerie ähnelt dem eukaryotischen RNAP II System, aber Genregulation erfolgt durch Transkriptionsregulatoren, die denen in Bakterien ähneln. Im Archaeon Pyrococcus furiosus kann TFB an Promotoren mit einem schwachen B-Erkennungselement (engl.: B recognition element, BRE) durch den TFB-Rekrutierungsfaktor 1 (TFB-RF1) stimuliert werden, der an ein konserviertes Promotorelement stromaufwärts des BRE bindet. Der molekulare Mechanismus und mögliche Konformationsänderungen der DNA sind noch nicht bekannt. Viele Archaeen haben Paraloga von TBP und TFB evolviert, die an Genregulation in Reaktion auf Stressbedingungen beteiligt sind. In Sulfolobus acidocaldarius wird TFB2, ein Paralog von TFB, zellzyklusabhängig exprimiert. Welche Funktion TFB2 im Rahmen der Transkriptionsinitiation spielt ist jedoch noch unerforscht.
Die Assemblierung von TFs an der Promotor-DNA ist dynamisch und eine wichtige Konformationsänderung bei diesem Prozess ist eine durch TBP induzierte Biegung der DNA um circa 90°. Diese Konformationsänderung kann durch Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) detektiert werden. FRET ist ein abstandsabhängiger, strahlungsfreier Prozess, mit dem Abstandsänderungen im Bereich von 1–10 nm mit hoher zeitlicher Auflösung gemessen werden können. In dieser Arbeit werden FRET-Messungen auf Einzelmolekülebene durchgeführt, wodurch die direkte Beobachtung verschiedener Konformationszustände einzelner Initiationskomplexe in Echtzeit möglich ist. Darüber hinaus wurden Kraftmessungen mit einem DNA Origami-basierten Nanogerät durchgeführt, das eine konstante Kraft im Piconewton-Bereich auf ein doppelsträngiges DNA-Fragment ausüben kann. Für FRET-Experimente wurde ein internes Totalreflektionsfluoreszenzmikroskop (engl.: total internal reflection fluorescence, TIRF) konstruiert. In dieser Arbeit wurden TIRF und konfokale Fluoreszenzmikroskopie eingesetzt um die molekularen Mechanismen der Transkription in archaeellen und eukaryotischen Transkriptionssystemen zu erforschen.
Die Untersuchung der schrittweisen Assemblierung des TFIIIB-Komplexes am U6 snRNA-Promotor zeigte, dass TBP-induzierte DNA-Biegung transient erfolgt, mit Bindungszeiten im Millisekundenbereich. Brf2 und Bdp1 können dynamische DNA/TBP-Komplexe stabilisieren. Kraftspektroskopiemessungen ergaben, dass die DNA-Bindung humaner TFs beeinträchtigt ist, wenn mechanische Kraft auf die DNA einwirkt. Der vollständige TFIIIB-Komplex kann bei Kräften bis zu 6,3 pN an DNA binden, während die Bindung von TBP und TBP/Brf2 bei 2,6 pN bzw. 6,3 pN stark reduziert war. Ein Vergleich mit den RNAP II-spezifischen Faktoren TFIIB und TFIIA liefert Hinweise darauf, dass die käfigartige Struktur des TFIIIB-Komplexes eine hohe Beständigkeit gegen mechanische Kräfte vermittelt.
Der S. acidocaldarius Faktor TFB2 trägt nicht zur Stabilisierung eines Promotor-DNA/TBP-Komplex bei und ist daher keine funktionsfähiger Transkriptionsinitiationsfaktor. Stattdessen konnte ein sechsfacher molarer Überschuss an TFB2 einen DNA-gebundenen TBP/TFB-Komplex destabilisieren, was auf eine regulatorische Rolle für TFB2 hindeutet.
TFB-RF1 kann die TFB-Rekrutierung sowohl an Promotoren mit schwachen als auch consensus BREs in ähnlichem Maße verbessern. Dabei wurden keine Konformationsänderungen der DNA beobachtet. Die Formierung eines gebogenen Promotor-DNA-Komplexes erfolgte jedoch bei Promotoren mit consensus BRE langsamer. Es ist anzunehmen, dass TFB-RF1 als eine sekundäre Bindungsstelle für TFB am Promotor fungiert.
DNA-Origami-basierte Kraftspektroskopie zeigte ferner, dass DNA-Biegung durch archaeelle Transkriptionsfaktoren kraftabhängig ist. Methanocaldococcus jannaschii TBP kann DNA allein biegen, während im P. furiosus Transkriptionssystem TBP und TFB benötigt werden. Für beide Systeme war bei einer an der DNA anliegenden Kraft von 6,2 pN die Effizienz der DNA-Biegung stark reduziert.
Zusammengenommen beleuchtet diese Arbeit konservierte Mechanismen, die von archaeellen und eukaryotischen Transkriptionssystemen genutzt werden um die Stabilität des TBP/TFIIB-ähnlichen Faktor-Komplexes zu modulieren, der den Kern des PIC bildet, wodurch Kontrolle über die Transkriptionsinitiation ermöglicht wird.
Metadata last modified: 11 Jan 2021 09:49
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