| License: Publishing license for publications excluding print on demand (7MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-455519
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.45551
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 12 April 2022 |
| Referee: | Prof. Dr. Thomas Dresselhaus and Prof. Dr. Klaus Grasser and Prof. Dr. Benedikt Kost and Prof. Dr. Gernot Längst and Prof. Dr. Joachim Griesenbeck |
| Date of exam: | 9 April 2021 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Pflanzenwissenschaften |
| Keywords: | Maize; CRP; double fertilization; RALF; POE; DEFL |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 45551 |
Abstract (German)
Um eine Doppelbefruchtung erfolgreich abzuschließen, benötigen blühende Pflanzen eine Batterie an Signalpeptiden, die die verschiedenen Prozesse von der Pollenkeimung über die Freisetzung der Spermazellen bis hin zur Verschmelzung der Gameten präzise regulieren. Kleine sekretierte cysteinreiche Peptide oder Proteine (CRPs) spielen eine Schlüsselrolle für die Zell-Zell-Kommunikation während der ...
Abstract (German)
Um eine Doppelbefruchtung erfolgreich abzuschließen, benötigen blühende Pflanzen eine Batterie an Signalpeptiden, die die verschiedenen Prozesse von der Pollenkeimung über die Freisetzung der Spermazellen bis hin zur Verschmelzung der Gameten präzise regulieren. Kleine sekretierte cysteinreiche Peptide oder Proteine (CRPs) spielen eine Schlüsselrolle für die Zell-Zell-Kommunikation während der verschiedenen Reproduktionsprozesse.
In dieser Arbeit werden in Kapitel 1 die Gametophytenentwicklung bei Angiospermen (Blütenpflanzen) und der Fortpflanzungsprozess kurz vorgestellt. Kapitel 2 beschreibt die Identifizierung und funktionelle Erforschung von Rapid Alkalinization Factor (RALF) Peptiden in Mais, die zu den am stärksten exprimierten CRP-Genen in Pollen gehören. Der Schwerpunkt von Kapitel 3 liegt auf den Interaktionen zwischen RALF-Peptiden und rezeptorähnlichen Kinasen, Co-Rezeptoren und Zellwandproteinen. Kapitel 4 beschreibt die Untersuchung von Pollen Ole e 1-like (POE) Proteinen in Mais und einem Defensin-like (DEFL) Protein, die CRP-Gruppen zugehörig sind, deren Gene spezifisch in Pollen und Pollenschläuchen exprimiert werden. Abschließend werden in Kapitel 5 die Ergebnisse aus dieser Arbeit in einem breiteren Kontext diskutiert und ein Ausblick auf weitere Studien gegeben.
Die Hauptschwerpunkte der Arbeit lagen auf RALF-Signalpeptiden und deren Funktionen während des Prozesses der Pollenschlauch-Wachstumskontrolle in Mais (Zea mays L.). Die Funktion von RALF-Peptiden bei der Aufrechterhaltung der Pollenschlauchintegrität während der Reproduktion wurde zuvor in Arabidopsis thaliana beschrieben, aber wie sich RALF-Peptide im Maisgenom verteilen, inwieweit Funktionen konserviert sind und ob es spezifische Funktionen im Mais gibt, war bisher unbekannt. Um die Verteilung und die Eigenschaften der RALF-Peptide im Mais zu erforschen, wurde ein Whole Genome Blast Searcher durchgeführt. Neben den 20 zuvor identifizierten ZmRALF-Genen wurden weitere vier ZmRALF-Gene gefunden. Eine phylogenetische Analyse wurde durchgeführt, um die 24 ZmRALF- und 37 AtRALF-Peptide zu vergleichen. Basierend auf Sequenzähnlichkeit und Strukturmerkmalen konnten die RALF-Peptide der beiden Arten in vier Kladen eingeteilt werden. Klade I und II sind typische RALF-Peptide, die ein Propeptid und YISY- sowie YY-Interaktionsdomänen enthalten. Klade III enthält nur RALF-Peptide aus Arabidopsis, die ein YISY enthalten, denen aber eine YY-Interaktionsdomäne fehlt. Klade IV RALF-Peptide sind kurz und haben keine der oben beschriebenen typischen Merkmale. Ihre Funktion(en) sind unbekannt. In dieser Arbeit wurden daher zwei Typen von RALF-Peptiden untersucht: ZmRALF2/3 aus Clade II und ZmRALF1/5 aus Clade IV. Sie sind die am häufigsten vorkommenden RALF-Gene in Mais, da ihr Transkript etwa 97% aller im Pollenschlauch exprimierten RALF-Gene ausmacht. Um die subzelluläre Lokalisation der ZmRALF-Peptide zu untersuchen, wurden eGFP-Fusionsproteine, getrieben durch den pollen-spezifischen AtRALF4-Promotor, in Arabidopsis thaliana transformiert. Nach der mikroskopischen Analyse des in vitro gekeimten Pollenschlauchs wurden ZmRALF2/3 hauptsächlich in der Zellwand nachgewiesen, während ZmRALF1/5 in Vesikeln/Granula im Zytoplasma lokalisiert waren, aber in vitro nicht sezerniert wurden. Um die Funktion der ZmRALF-Peptide weiter zu untersuchen, wurden RNA-Interferenz-Mutanten (RNAi-RALFs) erzeugt, um ZmRALF1/2/3 herunterzuregulieren. In RNAi-RALFs-Mutantenlinien wurde die Expression von ZmRALFs im Vergleich zu Wildtyp-Pollen auf etwa die Hälfte herunterreguliert. Die phänotypische Analyse der RNAi-RALFs-Mutanten zeigte, dass die in vitro gekeimten Pollenschläuche instabil waren und dazu neigten, in der subapikalen Region des Schlauchs zu platzen; die Übertragung der männlichen Gametophyten, aber nicht die Effizienz der weiblichen Übertragung waren signifikant verringert. Von Catharanthus roseus receptor like kinase 1-like proteins (CrRLK1Ls), LORELEI-like-GPI-anchored proteins (LLGs) und Leucine-riche repeat extensins (LRXs) wurde berichtet, dass sie mit typischen RALF-Peptiden in Arabidopsis thaliana und der Tomate interagieren. Um die Funktion dieser Interaktoren im RALF-Signalweg zu untersuchen, wurden Genom-Blasts durchgeführt. Es wurden 17 CrRLK1L-Protein-Gene, vier für LLGs und 17 für LRXs gefunden. Putative Mais-Homologe von Arabidopsis FERONIA (FER), ANXURE 1/2 (ANX1/2), Buddha's Paper Seal 1/2 (BUPS1/2), LLGs und LRXs wurden als ZmFERL1, ZmFERL4, ZmFERL7/9, ZmLLGs bzw. ZmPEXs bezeichnet. Abgesehen von ZmFERL1, das in männlichen gametophytischen Zellen nicht exprimiert wird, werden die anderen homologen Gene ausschließlich in Pollen und Pollenschläuchen exprimiert. Multiple Pull-Down-Assays bestätigten die Interaktion zwischen den Clade II RALF Peptiden ZmRALF2/3 und ihren putativen Interaktoren, während die Clade IV Peptide ZmRALF1/5 keine Interaktion mit diesen Proteinen zeigten. Die Bindungsaffinitäten zwischen ZmRALFs und ZmCrRLK1Ls und ZmPEX2 wurden mit Microscale Thermophoresis (MST) getestet. Demnach binden ZmRALF2/3 stark mit ZmPEX2, weniger stark mit ZmFERL4/7/9 und nur schwach mit ZmFERL1. Clade II RALF Peptide ZmRALF2/3 interagierten auch mit Arabidopsis ANXs/BUPSs/LRXs und umgekehrt, während Clade IV RALF Peptide ZmRALF1/5 dies nicht taten. Verschiedene CRISPR/sCas9-Mutanten wurden generiert und genotypisiert, um die Funktionen von ZmFERLs in zukünftigen Studien zu untersuchen.
Neben den RALFs, POE und DEFL wurden zwei weitere CRPs untersucht. In Mais gibt es 27 POE-Gene, die in drei Gruppen eingeteilt werden können. Diese Arbeit konzentrierte sich auf die POE-Gene der Gruppe I-A mit den Namen ZmPOE1.1 und ZmPOE1.2, die sich in Bezug auf Proteinsequenzen und Expressionsmuster sehr ähnlich sind. Um die Funktionen der ZmPOEs zu untersuchen, wurden RNA-Interferenz- und CRISPR/Cas9-Mutanten erzeugt. In den RNAi-POEs wurden ZmPOE1.1/1.2 im Vergleich zum Wildtyp auf etwa 20% herunterreguliert, aber es konnten keine offensichtlichen phänotypischen Defekte bei in vitro gekeimten Pollenschläuchen beobachtet werden. In Cas9-POEs-Linien wurden Fragmentdeletionen gefunden. Pollenschläuche von Cas9-POEs-Mutanten waren etwa 90 Minuten nach der Keimung in vitro instabil.
ZmDEFL1 wird hoch und ausschließlich in Pollen exprimiert. Eine RNA-Interferenz-Mutante wurde generiert, um die Funktion von ZmDEFL1 zu untersuchen. In der RNAi-DEFL1-Mutante war das Expressionsniveau von ZmDEFL1 im Vergleich zum Wildtyp auf 5% herunterreguliert. Allerdings konnte ich weder einen Effekt auf die Pollenkeimung und das Wachstum in vitro noch einen Defekt bei der Übertragung der männlichen Gametophyten feststellen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der RALF-Signalweg, der die Zellwandintegrität während des Pollenschlauchwachstums reguliert, zwischen Mais und Arabidopsis konserviert ist. ZmPOEs werden für das in vitro Pollenschlauchwachstum benötigt, aber es sind weitere Tests zum Funktionsmechanismus erforderlich. ZmDEFL1 erwies sich während der doppelten Befruchtung von Mais nicht als essentiell.
Translation of the abstract (English)
To successfully complete double fertilization, flowering plants require a battery of signaling peptides to precise regulate the various processes from pollen germination towards sperm cell release and gamete fusion. Small secreted cysteine-rich peptides or proteins (CRPs) play key roles for cell-cell communication during the various reproductive processes. In this work, Chapter 1 shortly ...
Translation of the abstract (English)
To successfully complete double fertilization, flowering plants require a battery of signaling peptides to precise regulate the various processes from pollen germination towards sperm cell release and gamete fusion. Small secreted cysteine-rich peptides or proteins (CRPs) play key roles for cell-cell communication during the various reproductive processes.
In this work, Chapter 1 shortly introduces gametophyte development in angiosperms (flowering plants) and the reproduction process. Chapter 2 describes the identification and functional exploration maize Rapid Alkalinization Factor (RALF) peptides belong to the most strongly expressed CRP genes in pollen. The focus of Chapter 3 is the interactions between RALF peptides and receptor-like kinases, co-receptors and cell wall proteins. Chapter 4 describes the investigation of maize Pollen Ole e 1-like (POE) proteins and a defensin-like (DEFL) protein belonging to CRP groups whose genes are specifically expressed in pollen and pollen tubes. Finally, Chapter 5 discusses the results from this work in a broader context and provides an outlook for further studies.
The major focuses of the thesis were on RALF signaling peptides and their functions during the process of pollen tube growth control in maize (Zea mays L.). The function of RALF peptides in maintaining pollen tube integrity during reproduction was previously described in Arabidopsis thaliana, but how RALF peptides distribute in the maize genome, to which extent functions are conserved and whether there are specific functions in maize were still unknown. To explore the distribution and features of maize RALF peptides, whole genome blast searchers were carried out. Beside the 20 ZmRALF genes identified previously, additional four ZmRALF genes were founded. Phylogenetic analysis was done to compare the 24 ZmRALF and 37 AtRALF peptides. Based on sequence similarity and structure features, RALF peptides form the two species could be classified into four clades. Clade I and II are typical RALF peptides containing a propeptide and YISY as well as YY interaction domains. Clade III contains only RALF peptides from Arabidopsis containing a YISY but lacking an YY interaction domain. Clade IV RALF peptides are short and lack all typical features described above. Their function(s) are unknown. This thesis therefore investigated two types of RALF peptides: ZmRALF2/3 from Clade II and ZmRALF1/5 from Clade IV. They are the most abundant RALF genes in maize as their transcript occupied about 97% of all pollen tube expressed RALF genes. To explore subcellular localization of ZmRALF peptides, eGFP-fusion proteins driven by the pollen-specific AtRALF4 promoter were transformed into Arabidopsis thaliana. According to microscopic analysis of in vitro germinated pollen tube, ZmRALF2/3 were mainly detected to the cell wall while ZmRALF1/5 localized in vesicles/granules to the cytoplasm, but were not secreted in vitro. To further investigate the function of ZmRALF peptides, RNA interference mutants (RNAi-RALFs) were generated to downregulate ZmRALF1/2/3. In RNAi-RALFs mutant lines, expression level of ZmRALFs were downregulated to about half compared with wild type pollen. Phenotypic analysis of RNAi-RALFs mutants showed that in vitro germinated pollen tubes were unstable and tend to burst in the subapical region of the tube; male gametophyte transmission, but not female transmission efficiency were significantly decreased. Catharanthus roseus receptor like kinase 1-like proteins (CrRLK1Ls), LORELEI-like-GPI-anchored proteins (LLGs), and Leucine-riche repeat extensins (LRXs) were reported to interact with typical RALF peptides in Arabidopsis thaliana and Tomato. To investigate the function of these interactors in RALF signaling pathway, genome blasts were carried out. 17 CrRLK1L protein genes, four for LLGs and 17 for LRXs were found. Putative maize homologues of Arabidopsis FERONIA (FER), ANXURE 1/2 (ANX1/2), Buddha’s Paper Seal 1/2 (BUPS1/2), LLGs and LRXs were named as ZmFERL1, ZmFERL4, ZmFERL7/9, ZmLLGs and ZmPEXs, respectively. Apart from ZmFERL1 that is not expressed in male gametophytic cells, the other homologues genes are exclusively expressed in pollen and pollen tubes. Multiple pull-down assays confirmed the interaction between Clade II RALF peptides ZmRALF2/3 and their putative interactors, while Clade IV peptides ZmRALF1/5 did not show any interaction with these proteins. Binding affinities between ZmRALFs and ZmCrRLK1Ls and ZmPEX2 were tested with Microscale Thermophoresis (MST). According to the result, ZmRALF2/3 strongly bind with ZmPEX2, less tightly with ZmFERL4/7/9, and only weakly with ZmFERL1. Clade II RALF peptides ZmRALF2/3 interacted also with Arabidopsis ANXs/BUPSs/LRXs and vice versa, while Clade IV RALF peptides ZmRALF1/5 did not. Different CRISPR/sCas9 mutants were generated and genotyped to investigate the functions of ZmFERLs in future studies.
Beside RALFs, POE and DEFL, two further CRPs were investigated. In maize, there are 27 POE genes, which could be classified into three groups. This work focused on Clade I-A POE gene named as ZmPOE1.1 and ZmPOE1.2, which are highly similar with each other regarding protein sequences and expression pattern. To investigate the functions of ZmPOEs, RNA interference and CRISPR/Cas9 mutants were generated. In RNAi-POEs, ZmPOE1.1/1.2 were downregulated to about 20% compared with wild type levels, but no obvious phenotypic defects could be observed using in vitro germinated pollen tubes. Fragment deletions were found in Cas9-POEs lines. Pollen tubes from Cas9-POEs mutants were unstable around 90 minutes after germination in vitro.
ZmDEFL1 is highly and exclusively expressed in pollen. An RNA interference mutant was generated to investigate the function ZmDEFL1. In RNAi-DEFL1, expression level of ZmDEFL1 was downregulated to 5% compared with wild type levels. However, I could not detect an effect on pollen germination and growth in vitro nor a male gametophyte transmission defect.
Taken together, the RALF signaling pathway, which regulates cell wall integrity during pollen tube growth is conserved between maize and Arabidopsis. ZmPOEs are required for in vitro pollen tube growth, but more tests are needed to the functional mechanism. ZmDEFL1 was not found to be essential during maize double fertilization.
Metadata last modified: 07 Sep 2022 08:22
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