| License: Creative Commons Attribution 4.0 PDF - Accepted Version (15MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-463133
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.46313
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 6 July 2022 |
| Referee: | Prof. Dr. Christoph Klein |
| Date of exam: | 6 July 2021 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für experimentelle Medizin und Therapieverfahren |
| Keywords: | Melanom, Neoantigen, Immuntherapie |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 500 Natural sciences & mathematics |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 46313 |
Abstract (English)
Malignant melanoma is an aggressive cancer with increasing incidence, frequent metastasis and poor prognosis. It is also an immunogenic cancer and clinical and experimental data point towards a pivotal role of neoantigens and neoantigen-reactive T cells in controlling melanoma. As mortality from metastatic melanoma is still high despite recent immunotherapy progress, all efforts must be directed ...
Abstract (English)
Malignant melanoma is an aggressive cancer with increasing incidence, frequent metastasis and poor prognosis. It is also an immunogenic cancer and clinical and experimental data point towards a pivotal role of neoantigens and neoantigen-reactive T cells in controlling melanoma. As mortality from metastatic melanoma is still high despite recent immunotherapy progress, all efforts must be directed to eliminate the metastatic seed - the disseminated cancer cells (DCCs) - early on, before lethal metastasis is established. As dissemination in melanoma starts early during primary tumor (PT) development and DCCs continue their evolution outside of the PT, DCCs can harbor different genetic alterations compared to the PT. However, therapeutic target decisions are currently based on the molecular characteristics of the PT and not on the target cells of adjuvant therapy, the DCCs. DCCs can be detected in sentinel lymph nodes (SLNs), which are routinely extirpated for diagnostic reasons. An ideal adjuvant therapy should eliminate all DCCs, but it is yet unclear whether early SLN-DCCs mirror the molecular characteristics of systemically spread cancer cells and can be used to identify truncal mutations for adjuvant, neoantigen-based immune therapy. The thesis addressed this fundamental question of adjuvant therapy by (i) analysing the phylogenetic relationship of longitudinally sampled DCCs and by (ii) exploring neonantigen conservation across these samples. To this end, more than 500 single DCCs and non-tumor control cells were isolated by micromanipulation from longitudinal samples of three melanoma patients, and subjected to single cell next generation sequencing for 12472 microsatellite (MS) markers and to copy number alteration (CNA) analysis. After successful optimization of sample preparations for MS-sequencing, cells from different patients and different cell lineages (hematopoietic vs. epithelial and tumor vs. non-tumor cells) within one patient could be separated. The phylogenetic trees of all three patients showed that SLN-DCCs clustered with tumor cells isolated at later stages of the disease. This indicated that SLN-DCCs isolated in the early disease phase might indeed serve as good surrogates for systemically spread tumor cells giving rise to metastasis at a later time point. These findings were supported by CNA analyses, showing that SLN-DCCs already harbored aberrations also present in cancer cells from non-sentinel lymph nodes or from cutaneous metastases. Moreover, phylogenetic trees indicated that parallel seeding of lymph nodes and metastases might be more likely than seeding in cascades. BRAF mutation analysis of one patient further pointed towards a mixture of cascadic and simultaneous colonization of lymph nodes and the blood stream. To identify truncal neoantigens and test for mechanisms of immune evasion, such as loss of HLA alleles, whole exome sequencing (WES) of DCCs from the three patients was conducted. WES revealed skin cancer-related UV signatures in tumor samples from two patients. For all patients, a high degree of shared exonic mutations and predicted peptides were detected between SLN-DCCs and cells from cutaneous or blood-derived metastases. This further supported the suitability of SLN-DCCs to serve as surrogates for systemic tumor cells detected during disease progression. The number of predicted peptides significantly correlated with the tumor burden of the lymph nodes and significantly increased with decreasing number of HLA alleles in one patient, in whom HLA analysis revealed a potential loss of heterozygosity (LOH), indicating immune pressure and HLA-LOH as a potential mechanism of immune evasion. In order to validate shared, candidate neoantigens and test for their immunogenicity, a test system was successfully established identifying antigen-specific T cells among tumor-reactive T cells by combining (i) expansion of tumor-reactive T cells from peripheral blood cells with (ii) specific recognition of in vitro differentiated antigen-presenting cells transfected with antigen-encoding minigenes. Whether identified candidate neoantigens were suitable for adjuvant immunotherapy, remains to be evaluated. In summary, the combination of phylogenetic analyses and WES for neoantigens explored the clinical utility of early disseminated cancer cells in sentinel lymph nodes beyond diagnosis, and pointed towards a pivotal role of SLN-DCCs for therapeutic target identification against early systemic cancer.
Translation of the abstract (German)
Das maligne Melanom ist ein aggressiver Krebs mit steigender Inzidenz, häufiger Metastasierung und schlechter Prognose. Es ist auch ein immunogener Krebs und klinische und experimentelle Daten deuten auf eine zentrale Rolle von Neoantigenen und neoantigen-reaktiven T-Zellen bei der Kontrolle des Melanoms hin. Da die Sterblichkeit beim metastasierten Melanom trotz der jüngsten Fortschritte in der ...
Translation of the abstract (German)
Das maligne Melanom ist ein aggressiver Krebs mit steigender Inzidenz, häufiger Metastasierung und schlechter Prognose. Es ist auch ein immunogener Krebs und klinische und experimentelle Daten deuten auf eine zentrale Rolle von Neoantigenen und neoantigen-reaktiven T-Zellen bei der Kontrolle des Melanoms hin. Da die Sterblichkeit beim metastasierten Melanom trotz der jüngsten Fortschritte in der Immuntherapie immer noch hoch ist, müssen alle Anstrengungen darauf gerichtet sein, den metastatischen Keim - die disseminierten Krebszellen (DCCs) - frühzeitig zu eliminieren, bevor tödliche Metastasen entstehen. Da die Disseminierung beim Melanom bereits während der Entwicklung des Primärtumors (PT) beginnt und die DCCs ihre Entwicklung außerhalb des PT fortsetzen, können die DCCs andere genetische Veränderungen aufweisen als der PT. Die Entscheidungen über therapeutische Zielstrukturen basieren jedoch derzeit auf den molekularen Eigenschaften des PT und nicht auf den Zielzellen der adjuvanten Therapie, den DCCs. DCCs können in Sentinel-Lymphknoten (SLNs) nachgewiesen werden, die aus diagnostischen Gründen routinemäßig entnommen werden. Eine ideale adjuvante Therapie sollte alle DCCs eliminieren. Es ist jedoch noch unklar, ob frühe SLN-DCCs die molekularen Eigenschaften von systemisch gestreuten Krebszellen widerspiegeln und zur Identifizierung von Stammmutationen für eine adjuvante, neoantigen-basierte Immuntherapie genutzt werden können. Die vorliegende Arbeit befasste sich mit dieser grundlegenden Frage der adjuvanten Therapie, indem sie (i) die phylogenetische Verwandtschaft von DCCs analysierte und (ii) die Neoantigene dieser Proben untersuchte. Zu diesem Zweck wurden mehr als 500 einzelne DCCs und Nicht-Tumor-Kontrollzellen durch Mikromanipulation aus Proben von drei Melanompatienten isoliert und einer Einzelzell-Sequenzierung für 12472 Mikrosatelliten (MS)-Marker sowie einer Analyse der Kopienzahlveränderung (CNA) unterzogen. Nach erfolgreicher Optimierung der Probenpräparationen für die MS-Sequenzierung konnten Zellen von verschiedenen Patienten und verschiedenen Zelllinien (hämatopoetische vs. epitheliale und Tumor- vs. Nicht-Tumor-Zellen) innerhalb eines Patienten getrennt werden. Die phylogenetischen Bäume aller drei Patienten zeigten, dass SLN-DCCs mit Tumorzellen clusterten, die in späteren Stadien der Erkrankung isoliert wurden. Dies deutet darauf hin, dass SLN-DCCs, die in der frühen Krankheitsphase isoliert wurden, tatsächlich als gute Surrogate für systemisch gestreute Tumorzellen dienen könnten, die zu einem späteren Zeitpunkt zur Metastasierung führen. Diese Befunde wurden durch CNA-Analysen unterstützt. Diese zeigten, dass SLN-DCCs bereits Aberrationen enthielten, die auch in Krebszellen aus Nicht-Wächter-Lymphknoten oder aus kutanen Metastasen vorhanden waren. Darüber hinaus deuteten phylogenetische Bäume darauf hin, dass eine parallele Streuung von Lymphknoten und Metastasen wahrscheinlicher ist als in Kaskaden. Die BRAF-Mutationsanalyse eines Patienten deutete zudem auf eine Mischung aus kaskadenartiger und gleichzeitiger Besiedlung von Lymphknoten und Blut hin. Um Neoantigenen zu identifizieren und auf Mechanismen der Immunevasion, wie den Verlust von HLA-Allelen, zu testen, wurde Whole-Exome-Sequenzierung (WES) der DCCs der drei Patienten durchgeführt. Die WES Daten zeigten hautkrebsbezogene UV-Signaturen in Tumorproben von zwei Patienten. Bei allen Patienten wurde ein hohes Maß an gemeinsamen exonischen Mutationen und vorhergesagten Peptiden zwischen SLN-DCCs und Zellen aus kutanen oder aus dem Blut stammenden Metastasen festgestellt. Dies unterstützte die Eignung von SLN-DCCs als Surrogat für systemische Tumorzellen, Die Anzahl der vorhergesagten Peptide korrelierte signifikant mit der Tumorlast der Lymphknoten und nahm mit abnehmender Anzahl der HLA-Allele bei einem Patienten signifikant zu. Dies wies auf Immundruck und Verlust der Heterozygotie von HLA-Allelen als potenziellen Mechanismus der Immunevasion hin. Um gemeinsame Kandidaten-Neoantigene zu validieren und auf ihre Immunogenität zu testen, wurde erfolgreich ein Testsystem etabliert, das antigenspezifische T-Zellen unter den tumorreaktiven T-Zellen identifiziert, indem (i) die Expansion tumorreaktiver T-Zellen aus peripheren Blutzellen mit (ii) der spezifischen Erkennung von in vitro differenzierten Antigen-präsentierenden Zellen, die mit Antigen-kodierenden Minigenen transfiziert wurden, kombiniert wurde. Ob die identifizierten Kandidaten-Neoantigene für eine adjuvante Immuntherapie geeignet sind, muss noch untersucht werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Kombination aus phylogenetischen Analysen und WES für Neoantigene den klinischen Nutzen von früh disseminierten Krebszellen in Sentinel-Lymphknoten über die Diagnose hinaus erforscht und auf eine zentrale Rolle von SLN-DCCs für die therapeutische Zielidentifizierung gegen frühen systemischen Krebs hinweist.
Metadata last modified: 06 Jul 2022 06:59
Owner only: item control page
Download Statistics