| License: Creative Commons Attribution No Derivatives 4.0 (36MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-477818
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.47781
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 20 May 2022 |
| Referee: | Prof. Dr. Frank-Michael Matysik |
| Date of exam: | 23 July 2021 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik > Instrumentelle Analytik (Prof. Frank-Michael Matysik) |
| Keywords: | CE(SDS); Mass spectrometry; Protein analysis |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Partially |
| Item ID: | 47781 |
Abstract (English)
Size-based protein separation by CE(SDS) is indispensable for process and quality control in the biopharmaceutical industry and is commonly applied for purity assessment on behalf of drug approval. To overcome the challenge of uncertain peak identification of CE(SDS)-separated fragments and impurities, here, the first online hyphenation with mass spectrometry is presented. This hyphenation is ...
Abstract (English)
Size-based protein separation by CE(SDS) is indispensable for process and quality control in the biopharmaceutical industry and is commonly applied for purity assessment on behalf of drug approval. To overcome the challenge of uncertain peak identification of CE(SDS)-separated fragments and impurities, here, the first online hyphenation with mass spectrometry is presented. This hyphenation is achieved by introducing a second electrophoretic, MS-compatible CZE dimension after the first generic CE(SDS) separation. Both dimensions are hyphenated via a 4-port nanoliter valve that is commercially available from VICI AG International. As soon as the peak of interest of the CE(SDS) separation reaches the sample loop, the separation is stopped. Due to the very stable SDS-protein complex that can not be separated electrophoretically in the CZE dimension alone, a decomplexation with a solvent and a cationic surfactant is required. Therefore, simultaneously to the separation in the 1D, methanol as presample and CTAB (solved in methanol : water (1:1)) as postsample zone are injected and positioned via a C4D detector in the second CZE dimension. The peak of interest is then transferred via a heart-cut approach between the decomplexation zones in the 2D. With this set-up, it was possible to demonstrate the proof of principle. Universal application of the mass spectrometric CE(SDS) protein characterization is presented by soybean protein analysis. By analyzing several mAb fragments, the suitability and power of the 2D system for pertinent biopharmaceutical questions are proven. The intact mass determination facilitate identification of these fragments directly from generic CE(SDS) separation for the first time. In addition, the analysis allows a deeper insight, revealing migration order shifts and detection of several fragments, migrating simultaneously in the CE(SDS) dimension. Detection of these proteoforms resulting from only one CE(SDS) peak demonstrates the necessity of a more detailed investigation that can only be achieved by mass spectrometry hyphenation.
One major drawback of this 4-port nanoliter valve approach is the system and measurement instability due to frequently occurring current leakage. This current leakage is mainly related to the utilized 4-port nanoliter valves material and design, with distances of less than 1 mm between the separation dimensions. Additionally, the exact positioning of the CE(SDS) peak from the 1D in between the decomplexation zones in the 2D is crucial for successful decomplexation and directly related to MS signal intensity. For these main reasons, further development of the nanoliter valve and method adaptation was the primary aim of the second part of this work to improve system and measurement stability. Therefore, an 8-port nanoliter valve was developed and designed.
To allow immediate and unambiguous identification and characterization of CE(SDS)- separated peaks, the optimized system was hyphenated with top-down mass spectrometry. After successful hyphenation of the 2D system with the Orbitrap MS via nanoflow sheath liquid interface, method compatibility of the developed top-down MS method with the decomplexation strategy was tested. It was possible to prove that concentration down to 0.03 mg/mL of NIST mAb LC can be analysed by top-down MS analysis. Furthermore, the presence of intra disulfide bonds was verified by intact mass determination and MS2 fragmentation. In the last part, the identification and characterization of stress-induced fragments of two different mAbs were performed. Both mAb fragments were identified as Fc fragments of the HC, and the cleavage mechanism could be suggested. This identification was only feasible by MS2 top-down measurements and not possible by intact mass analysis alone, representing the value of the third part of this work.
The here presented work demonstrates the first online mass spectrometric characterization of generic CE(SDS)-separated proteins. It is shown that intact mass determination strongly supports the identification of these proteins and mAb fragments. The observation of unexpected migration order shift and several masses of proteoforms by analyzing only one CE(SDS) peak confirm the ambiguity of optical detection alone. Top-down experiments verify the strength of direct identification of mAb fragments and PTMs like the presence of disulfide bonds, which can not be distinguished by intact mass determination alone. This direct and unambiguous identification of CE(SDS)-separated proteins provides a detailed insight. It facilitates the understanding of protein stability and fragmentation, thereby supporting the production, safety and efficacy assurance of biopharmaceuticals.
Translation of the abstract (German)
Größenabhängige Trennung von Proteinen mittels CE(SDS) ist ein wichtiger Bestandteil in der Prozess- und Qualitätskontrolle in der biopharmazeutischen Industrie. Sie dient meist der Reinheits- und Stabilitätsbestimmung und wird für die Charakterisierung von Biopharmazeutika bei der Zulassung verwendet. Um die Peakidentifikation von CE(SDS)- getrennten Fragmenten und Verunreinigungen zu ...
Translation of the abstract (German)
Größenabhängige Trennung von Proteinen mittels CE(SDS) ist ein wichtiger Bestandteil in der Prozess- und Qualitätskontrolle in der biopharmazeutischen Industrie. Sie dient meist der Reinheits- und Stabilitätsbestimmung und wird für die Charakterisierung von Biopharmazeutika bei der Zulassung verwendet. Um die Peakidentifikation von CE(SDS)- getrennten Fragmenten und Verunreinigungen zu ermöglichen, wird hier die erste Kopplung von CE(SDS)-Trennung mit der Massenspektrometrie präsentiert. Diese Kopplung wird durch eine zweite elektrophoretische, MS-kompatible CZE-Trenndimension ermöglicht, die zwischen der CE(SDS)-Trennung und dem Massenspektrometer geschaltet ist. Beide Trenndimensionen sind durch ein Nanoliterventil, hier ein kommerziell erhältliches 4-Wegeventil der VICI AG International, miteinander verbunden. Sobald der zu analysierende CE(SDS)-Peak die Probenschlaufe des Ventils erreicht hat, wird die Trennung gestoppt. Da der SDS-Protein-Komplex sehr stabil ist, kann er nicht durch die alleinige elektrophoretische Trennung in der CZE-Dimension aufgetrennt werden. Deshalb ist es notwendig, in der 2D eine Dekomplexierungsstrategie mit einem Lösungsmittel und einem kationischen Tensid anzuwenden. Dazu wird parallel zur Trennung in der 1D Methanol und CTAB in der 2D injiziert und durch einen C4D-Detektor positioniert. Der zu analysierende SDS-Peak wird mittels Heart-cut zwischen die positionierten Dekomplexierungszonen in der 2D transferiert.
Mit diesem Aufbau ist es gelungen, die Machbarkeit aufzuzeigen und eine Nachweisgrenze zu bestimmen. Durch die Analyse von mehreren Antikörperfragmenten konnte der große Nutzen des 2D-Systems bei biopharmazeutischen Fragestellungen aufgezeigt werden. Zum ersten Mal wird durch direkter Intaktmassenbestimmung von CE(SDS)-getrennten Proteinen die Identifikation unterstützt. Dieser detailreiche Einblick in die CE(SDS)-Trennung ermöglicht die Beobachtung unerwarteter Migrationsreihenfolgen und die Migration von verschiedenen Fragmenten zur gleichen Zeit. Besonders die unzureichende Trennung von Proteofomen mittels CE(SDS) verdeutlicht die Notwendigkeit einer detaillierteren Detektion, die durch Massenspektrometrie ermöglicht wird.
Einer der größten Herausforderungen die sich bei der Verwendung des 4-Wegeventils herausstellte, das im ersten Teil dieser Arbeit verwendet wurde, ist die unzureichende System- und Messstabilität durch auftretenden Kriechstrom. Dieser Kriechstrom ist ein Resultat aus der Materialwahl und der Geometrie des kommerziell erhältlichen 4-Wegeventils, bei dem die Distanzen zwischen den Trenndimensionen unter 1 mm betragen. Zudem trägt eine ungenaue Positionierung der CE(SDS)-getrennten Proteinen der 1D inmitten der Dekomplexierungszonen in der 2D zur Reduzierung der Dekomplexierungseffizienz und somit zur Abnahme der MS-Signalintensität bei. Aus diesen Gründen wurden in dem zweiten Teil dieser Arbeit die Weiterentwicklung des Nanoliterwegeventils und die entsprechende Methodenanpassung verfolgt, um die System- und Messstabilität zu verbessern. Dafür wurde ein 8-Wegenanoliterventil entwickelt und entworfen.
Um eine direkte und eindeutige Identifizierung und Charakterisierung der CE(SDS)-getrennten Proteine zu ermöglichen, wurde das optimierte System mit Top-down-Massenspektrometrie gekoppelt. Nach der erfolgreichen Kopplung des 2D-Systems mit dem Orbitrap-MS durch ein nanoflow-sheath-liquid Interface, wurde die Methodenkompatibilität der entwickelten Top-down-Methode und der Dekomplexierungsstrategie getestet. Es war möglich die leichte Kette des NIST-Antikörpers bei einer Probenkonzentration von 0,03 mg/mL zu analysieren. Des Weiteren konnte die Präsenz von intakten Intra-Disulfidbrücken mittels Intaktmasse und MS2-Fragmentierung bestätigt werden. Im letzten Teil wurden stressinduzierte Fragmente von zwei unterschiedlichen Antikörpern identifiziert und charakterisiert. Beide Antikörperfragmente konnten als Fc-Fragmente der schweren Kette identifiziert und der dazugehörige Spaltungsmechanismus vorgeschlagen werden. Diese Identifikation wurde nur durch die MS2 Top-down-Messungen ermöglicht und wäre durch alleinige Intaktmassenbestimmung nicht realisierbar gewesen. Dies verdeutlicht die Bedeutung des dritten Teils dieser Arbeit.
Die hier präsentierte Arbeit zeigt die erste, online massenspektrometrische Charakterisierung von generisch CE(SDS)-getrennten Proteinen. Durch diese Intaktmassenbestimmung wird die Identifikation von Proteinen und Antikörperfragmenten deutlich unterstützt. Die Beobachtung von unerwarteten Migrationsreihenfolgen und die Messung von mehreren Intaktmassen von unterschiedlichen Proteoformen bei gleicher Migrationszeit, verdeutlichen die Limitierungen der optischen Detektion. Durch Top-down-Experimente konnte die Stärke der direkten Identifikation von Antikörperfragmenten und deren PTMs, wie die Präsenz von Disulfidbrücken, verdeutlicht werden, welche durch alleinige Intaktmassenbestimmung nicht möglich ist. Die direkte und eindeutige Identifikation der CE(SDS)-getrennten Proteine ermöglicht einen detaillierten Einblick. Dieser trägt zu einem besseren Verständnis der Proteinstabilität und -fragmentierung bei, das für den Herstellungsprozess und zur Sicherstellung der Wirksamkeit und Sicherheit von Biopharmazeutika von großer Bedeutung ist.
Metadata last modified: 20 May 2022 06:27
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