| License: Creative Commons Attribution 4.0 (12MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-493235
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.49323
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Date: | 1 August 2022 |
| Referee: | Prof. Dr. Joachim Wegener |
| Date of exam: | 10 September 2021 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik > Bioanalytik und Biosensorik (Prof. Joachim Wegener) |
| Keywords: | Oxygen, pH, Microphysiometry |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 49323 |
Abstract (English)
This thesis was focused on monitoring two essential parameters of life in cell and tissue culture: oxygen and pH. Oxygen tension and pH are two fundamental indicators for metabolic activity and they allow discriminating between normal and cancerous tissue. The parameters were analyzed on the one hand by using analyte-sensitive, planar sensor foils detecting changes in the microenvironment of ...
Abstract (English)
This thesis was focused on monitoring two essential parameters of life in cell and tissue culture: oxygen and pH. Oxygen tension and pH are two fundamental indicators for metabolic activity and they allow discriminating between normal and cancerous tissue. The parameters were analyzed on the one hand by using analyte-sensitive, planar sensor foils detecting changes in the microenvironment of cells and on the other hand by applying different extracellular pH values to see how cells reacted in different developmental stages or phenotypes. Four different cell lines were analyzed: (i) NRK cells representing normal cells, (ii) A549 cells which are human lung cancer cells and (iii) SK-MEL-28 and SpiCa cells which are two human skin cancer subtypes.
Initial methodological investigations demonstrated the high spatial resolution of the oxygen-sensitive sensor foils. The experiments yielded highly cell line-dependent respiratory activities and oxygen consumption rates. The experiments confirmed a highly expected cell line-specific oxygen uptake and consumption reflecting that different tissue types in the body are also exposed to different oxygen tensions. Experiments carried out with pre-cultured spheroids showed differences in the emerging oxygen gradients beneath the tissue depending on: (i) previous adhesion and cultivation times, (ii) structural properties of the spheroid meaning whether it was densely packed of exhibited a softer, formable structure and (iii) the individual cell line.
Vertical oxygen gradients were detected by using triangular glass prisms, with one leg of the prism being covered with the oxygen-sensitive sensor foil. The prisms were suspended in the supernatant medium above adherent cell monolayers. The device allowed for the mapping of vertical oxygen gradients which revealed emerging oxygen concentration gradients depending on the number of metabolically active cells on the surface, the height of the culture medium and the geometry of the respective cell culture vessel.
Besides the detection of oxygen concentrations beneath cells as an indicator of their respiration, the pH as the second key parameter was systematically varied in the supernatant medium and several cellular phenotypes were analyzed as a function of pH. Overall, a stronger inhibition of phenotypic behavior was observed for all the cell lines under extracellular acidification than alkaline milieus could increase the phenotypic activity. On the contrary, alkaline conditions even led to a slightly lower cellular response in the case of the cancerous cells.To complete the picture, the intracellular pHi was detected as a function of well-defined extracellular pHe conditions. Intracellular pHi, analyzed with the help of the dye BCECF. The more alkaline the extracellular environment was, the more aligned were the pHi and the pHe value. The studies of this thesis highlight how important a detailed cell characterization is to understand cellular responses to certain stimulations in order to be able to revert to this knowledge in the development of targeted drug design for therapeutics and diagnostics.
The last two chapters describe how the experimental techniques to monitor oxygen consumption and phenotypic behavior have been applied in toxicity studies. The influence of BPA on the respiration activity of NRK cells yielded EC50 values between (149 ± 64) µM ((76 ± 5) µM for the time intervall between 6.5 – 9 h of BPA exposure) and (159 ± 235) µM for the sensor spot (SDR®) and sensor foil (VisiSens TD) based experiments, respectively.
The influence of glyphosate on the cellular respiration of NRK cells was monitored using the oxygen-sensitive sensor foil. The experiments showed a concentration-independent, slightly inhibited respiration under the exposure to pure glyphosate and a strictly concentration-dependent signal under the influence of glyphosate in the Roundup® formulation with a significantly slower respiration at high concentrations. Complementarily performed studies monitoring the acute toxicity on NRK cells yielded EC50 values between (13.8 ± 0.6) mM (glyphosate) and (4.0 ± 0.7) mM (Roundup®) detected via ECISTM and EC50 values between (19 ± 8) mM (glyphosate) and (3.0 ± 0.2) mM (Roundup®) performed via a PrestoBlueTM cell viability assay.
Translation of the abstract (German)
Das zentrale Thema dieser Arbeit war die Untersuchung der beiden essenziellen Metabolite Sauerstoff und pH-Wert, die sowohl über metabolische Funktionen und Aktivitäten bestimmen, als auch die Möglichkeit bieten, zwischen gesundem Gewebe und krebsartigen Zellverbänden zu unterscheiden. Die Substanzen wurden dahin gehend untersucht, dass einerseits Änderungen in der direkten Umgebung der Zellen ...
Translation of the abstract (German)
Das zentrale Thema dieser Arbeit war die Untersuchung der beiden essenziellen Metabolite Sauerstoff und pH-Wert, die sowohl über metabolische Funktionen und Aktivitäten bestimmen, als auch die Möglichkeit bieten, zwischen gesundem Gewebe und krebsartigen Zellverbänden zu unterscheiden. Die Substanzen wurden dahin gehend untersucht, dass einerseits Änderungen in der direkten Umgebung der Zellen mittels analytsensitiven and ebenflächigen Sensorfolien analysiert wurden und andererseits wurden verschiedene extrazelluläre pH Werte verwendet, um Zellreaktionen während verschiedener Entwicklungsstadien oder Phänotypen zu beobachten. Dabei wurden vier verschiedene Zelllinien untersucht: (i) NRK Zellen als Modelzelllinie für gesunde Zellen, (ii) A549 Lungenkrebszellen und (iii) SK-MEL-28 und SpiCa Zellen, welche zwei verschiedene Hautkrebszelllinien darstellen.
Anfängliche methodische Untersuchungen konnten die hohe Ortsauflösung der sauerstoffsensitiven Sensorfolie zeigen, die zur Bestimmung der Sauerstoffverbrauchsraten eingesetzt wurden. Die Experimente ergaben zudem sehr zelllinienspezifische Atmungsaktivitäten und Veratmungsraten. Die ratiometrische Ausleseweise ermöglichte die gleichzeitige Untersuchung von mehreren Zelllinien, welche adhärent auf einer Sensorfolie wuchsen, und auch die Visualisierung von Sauerstoffgradienten unterhalb von dreidimensionalem Gewebe war möglich. Experimente, welche mit zuvor kultivierten Sphäroiden durchgeführt wurden, konnten Unterschiede in den unterhalb des Gewebes auftretenden Sauerstoffgradienten belegen. Diese Sauerstoffgradienten waren abhängig von (i) der vorangegangenen Adhäsions- und Kulturdauer, (ii) den strukturellen Eigenschaften der Sphäroide, also ob sie von dicht gepackter oder von eher weicher, formbarer Struktur waren und (iii) der jeweiligen Zelllinie selbst.
Für die Detektion vertikaler Sauerstoffgradienten wurden dreieckige Glasprismen verwendet, bei denen eine Seite mit der sauerstoffsensitiven Folie versehen wurde. Diese Prismen wurden dann im überstehenden Medium oberhalb der adhärenten Zellschicht platziert. Diese Anordnung erlaubte die Visualisierung vertikaler Sauerstoffgradienten und in der Folge die Schlussfolgerung, dass auftretende Sauerstoffkonzentrationsgradienten von der Zellanzahl auf der Wachstumsfläche, der Höhe der überstehenden Flüssigkeitssäule und der Geometrie der Zellkulturgefäße abhängig waren.
Neben der Detektion der durch Zellatmung verursachten Sauerstoffkonzentrationsänderung unterhalb der Zellen, wurde auch der zweite Parameter – der pH-Wert im Medium – systematisch variiert und verschiedene Zellverhalten als Funktion des pH-Wertes überwacht.
Im Allgemeinen wurde bei einer extrazellulären Ansäuerung das phänotypische Verhalten stärker inhibiert, als es unter basischen extrazellulären Bedingungen erhöht wurde. Ganz im Gegenteil führten basische Bedingungen, verglichen mit einem physiologischen pH Wert, sogar zu leicht niedrigeren Zellantworten bei den Krebszellen. Zur Vervollständigung der Studie wurde der intrazelluläre pH-Wert in Abhängigkeit von äußeren Inkubationslösungen mit systematisch variiertem pH-Wert untersucht. Der vorliegende, intrazelluläre pH-Wert wurde mittels dem Farbstoff BCECF untersucht. Je alkalischer das extrazelluläre Medium war, desto mehr glichen sich pHi- und pHe-Werte aneinander an. Dieses Wissen kann für die Entwicklung zielgerichteter Medikamente sowohl für die Therapie als auch für die Diagnose von großem Nutzen sein.
In den letzten beiden Kapiteln wurde beschrieben, wie die experimentellen Techniken zur Untersuchung des Sauerstoffverbrauches und des phänotypischen Verhaltens genutzt werden können, um umfangreiche Toxizitätsstudien durchzuführen. Die Atmungsaktivitäten der NRK Zellen unter dem Einfluss von BPA ergaben EC50-Werte von (149 ± 64) µM mit Hilfe der Technik des Sensorspots (SDR®) ((76 ± 5) µM unter BPA Einfluss für das Zeitintervall von 6.5 – 9 h) und (159 ± 235) µM wurden mit Hilfe der Sensorfolie (VisiSens TD) bestimmt.
Der Einfluss von Glyphosat auf die zelluläre Atmung von NRK Zellen wurde mittels der sauerstoffsensitiven Sensorfolie untersucht. Die Experimente zeigten eine konzentrationsunabhängige, leicht inhibierte Atmung der Zellen unter dem Einfluss von reinem Glyphosat und in Gegenwart des Mittels Roundup® eine streng konzentrationsabhängige Atmungsaktivität der Zellen, welche bei hohen Konzentrationen stark inhibiert war. Ergänzende Studien zur Untersuchung der akuten Toxizität auf NRK Zellen ergaben EC50 Werte zwischen (13.8 ± 0.6) mM (Glyphosat) und (4.0 ± 0.7) mM (Roundup®) basierend auf den ECISTM Experimenten und EC50 Werte zwischen (19 ± 8) mM (Glyphosat) and (3.0 ± 0.2) mM (Roundup®) anhand der PrestoBlueTM Viabilitätsassays.
Metadata last modified: 01 Aug 2022 08:05
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